酶电极法测定海藻糖含量

王子辉，楚 杰，王君高，刘可春

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353；2.山东省科学院生物研究所，山东济南250014）

酶电极法测定海藻糖含量

王子辉1，楚 杰2，*，王君高1，刘可春2

（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南250353；2.山东省科学院生物研究所，山东济南250014）

对酶电极法测定海藻糖含量进行了研究，实验中首先探索了硫酸和盐酸水解海藻糖的条件。结果表明：海藻糖水解的最佳条件是5%的盐酸在100℃下水解5h或10%的硫酸在100℃下水解5h。水解后用酶电极法测定葡萄糖含量，并与硫酸-苯酚法比较，酶电极法测定海藻糖含量基本上消除了杂质的干扰，重现性及精密性较高，是一种理想的测定方法。

海藻糖，酸，水解，酶电极法，生物传感器

海藻糖（trehalose）是一种安全的天然糖类，1832年由Wiggers将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来。海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定［1］。科学家们发现，沙漠植物膜叶卷柏在干旱时几近枯死，遇水后却又可以奇迹般复活；一些昆虫即使在-80℃下仍然能够生存，就是它们体内的海藻糖创造的生命奇迹［2］。海藻糖因此在科学界素有“生命之糖”的美誉［3］。它还是一种新型的食品添加剂，可广泛地用于食品加工业，尤其在水果和水产品保鲜方面更有突出的优点。在研究酵母的过程中，研究人员发现，海藻糖含量高的酵母菌比含量低的酵母菌具有更强的抗干燥能力，海藻糖含量高的活性干酵母保存期长，海藻糖含量低的活性干酵母保存期短。因此，研究酵母中海藻糖含量的测定具有重要的实践价值。测定酵母中海藻糖含量的主要方法有蒽酮比色法、硫酸-苯酚法、酶水解法和HPLC法等。蒽酮法与硫酸-苯酚法基于糖和蒽酮的显色反应原理，但在遇到能与其反应的其他物质时，常使测定值有偏差；有人采用海藻糖酶水解法测定海藻糖含量，但也有一定的限制［4］；采用HPLC方法，不仅需要昂贵的仪器和试剂，而且在测定前，还需对样品进行多步处理，耗时多，操作繁琐［5］。因此，寻找一种既准确、又简便的海藻糖测定方法已成为目前研究工作的当务之急。本实验首先利用酸将海藻糖水解成葡萄糖，然后用生物传感分析仪测定水解液中葡萄糖含量，进而定量测定海藻糖含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

标准海藻糖、标准葡萄糖、98%浓硫酸、36%浓盐酸、酒石酸、柠檬酸、苯酚 均为分析纯。

SBA-40C型葡萄糖生物传感器 山东省科学院生物研究所研制。

1.2 实验方法［6-8］

1.2.1 酶电极法测定海藻糖含量

1.2.1.1 水解酸种类的选择 配制5%的盐酸、5%硫酸、30%柠檬酸、30%酒石酸溶液备用，准确称取4份 0.1000g海藻糖，加入4个以各酸名标号的小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各个小三角瓶中，完全溶解之后用玻璃纸密封，在100℃下水解5h。水解完毕，调节溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物传感器测定水解液中葡萄糖含量，计算海藻糖的含量。

1.2.1.2 水解酸浓度的选择 配制3%、4%、5%、6%的盐酸和10%、20%、30%、40%的硫酸备用。准确称取8份0.1000g海藻糖，加入8个以各酸和浓度标号小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各个小三角瓶中，完全溶解之后密封，在100℃下水解5h。水解完毕，调节溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物传感器测定水解液中葡萄糖含量，计算海藻糖的含量。

1.2.1.3 最适水解时间的选择 配制5%的盐酸和10%硫酸溶液备用，准确称取8份0.1000g海藻糖，加入8个以各酸和浓度标号小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各个小三角瓶中，完全溶解之后密封，在100℃下水解3、4、5、6h。水解完毕，调节溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物传感器测定水解液中葡萄糖含量，计算海藻糖的含量。

1.2.1.4 最适水解温度的选择 配制5%的盐酸和10%硫酸溶液备用，准确称取8份0.1000g海藻糖加入8个以各酸和浓度标号小三角瓶中，吸取30mL各酸加入各个小三角瓶中，完全溶解之后用玻璃纸密封，在70、80、90、100℃下水解5h。水解完毕，调节溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物传感器测定水解液中葡萄糖含量，计算海藻糖的含量。

1.2.2 与苯酚-硫酸法［9］比较

1.2.3 精密度检测 准确称取5份0.1000g海藻糖加入1～5号的小三角瓶中，加入30mL水，完全溶解之后，用100mL容量瓶定容，用苯酚硫酸法测定溶液中海藻糖含量。

配制5%的盐酸溶液备用，准确称取5份0.1000g海藻糖加入6～10号的小三角瓶中，吸取已配好的5%的盐酸溶液30mL加入各瓶中，用玻璃纸密封，在100℃下水解5h。水解完毕，调节溶液的pH至中性，100mL容量瓶定容。用生物传感器测定水解液中葡萄糖含量，计算海藻糖的含量。

1.2.4 重复性检测 取1.2.3中的5号管，用苯酚硫酸法测定5次溶液中海藻糖含量；同时取1.2.3中的10号管用生物传感器测定5次水解液中葡萄糖含量，计算海藻糖的含量。两种方法进行对比。

2 结果与讨论

2.1 水解酸种类的选择

实验中所选的四种酸水解海藻糖的结果见图1，由图1可以明显看出，柠檬酸和酒石酸两个弱酸的水解结果明显不如盐酸和硫酸两个强酸的水解结果理想。故接下来的实验中采用盐酸和硫酸两个强酸作对比。

2.2 水解酸浓度的选择

盐酸和硫酸各浓度水解海藻糖结果见图2、图3，3%～6%盐酸的水解海藻糖含量先升后降，在5%的盐酸处达到最大值，故本实验选定的盐酸的最适水解浓度为5%。同样，5%～30%的硫酸水解结果也是先升后降，在10%处达到最大值，故本实验选定的硫酸的最适水解浓度为10%。

图1 各酸的实验结果

图2 盐酸各浓度的实验结果

图3 硫酸各浓度的实验结果

2.3 最适水解时间的选择

5%HCl、10%H2SO4各水解时间的水解海藻糖的结果见图4、图5，显而易见，从3h到5h时，盐酸和硫酸对海藻糖的水解率都随时间的增加而增加，在5h时达到最大值而后下降，分析原因可能是海藻糖水解的葡萄糖长时间处于酸性环境中，生成葡萄糖酸的结果，故本实验选定的最适水解时间为5h。

图4 5%HCl水解时间的实验结果

2.4 最适水解温度的选择

5%HCl、10%H2SO4各水解温度的水解结果如图6、图7所示，从图6、图7中可以看出，从70～100℃，5%HCl、10%H2SO4对海藻糖水解率是持续增大的，在100℃时基本达到最大值，故本实验选定的最适水解温度为100℃。

表1 苯酚硫酸法精密度测试结果

表2 生物传感器精密度测试结果

表3 重复性测试结果

图5 10%H2SO4水解时间的实验结果

图6 5%HCl水解温度的实验结果

图7 10%H2SO4水解温度的实验结果

2.5 精密度检测

精密度是指多次重复测定同一量时各测定值之间彼此相符合的程度，它表示测量的再现性，通常以算术平均差来量度。本实验即用算术平均差衡量实验方法的精密度。

精密度测试结果如表1、表2所示，从表1、表2可以看出，苯酚硫酸法测定结果的精密度波动较大，而用葡萄糖生物传感器测定的结果波动相对平缓，所以生物传感器法的精密度比较好，故本实验采用生物传感器法测定海藻糖。

2.6 重复性检测

重复性是指在相同测量条件下，对同一被测量物质进行连续多次测量所得结果之间的一致性，重复性常用实验标准差来量度，本实验采用标准差衡量实验方法的重复性。

重复性测试如表3所示，从表3可以看出，苯酚硫酸法测定结果标准差比生物传感器法所测结果的标准差高，所以其重复性比较低，这表明生物传感器法比较准确，故本实验采用生物传感器测定海藻糖。

3 结论

3.1 本实验对酶电极法测定海藻糖含量进行了初步研究，因海藻糖是由两分子葡萄糖组成，本实验中首先将海藻糖水解成葡萄糖，然后用葡萄糖生物传感器测定葡萄糖含量，从而推断出海藻糖的含量；实验中初步采用了四种酸对海藻糖进行了水解，并得到水解海藻糖的最佳条件：盐酸水解法为5%的盐酸在100℃下水解5h；硫酸水解法为10%的硫酸在100℃下水解5h。相比较而言，要使硫酸达到和盐酸相近的水解效果，所需硫酸的浓度是盐酸浓度的一倍，从节约资源的角度考虑，应该选盐酸作为水解酸。

3.2 从准确性和重复性检测两个指标来看，生物传感器法测定结果的准确性及重复性要优于苯酚硫酸法，它对底物具有高度专一性，仅对溶液中的葡萄糖反应，克服了苯酚硫酸法手工测定及非糖类物质干扰带来的误差，故本实验拟采用生物传感器法测定葡萄糖含量，通过换算计算出海藻糖含量。

此外，在后续的研究过程中，还可以用此方法测定酵母中的海藻糖含量，相信会得到理想的结果。

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［2］袁勤生.隐生生物中的典型化合物——海藻糖［J］.中国生化药物杂志，1999，20（1）：48-50.

［3］Philip Ball.Fresh and dry［N］.Nature News，2000（7）：17.

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［5］王蕾，郑璞.DNS法定量测定海藻糖的研究［J］.食品科技检测技术，2004，82（2）：82-84.

［6］倪炜，常雅宁，等.香蕉皮水解工艺的初步研究［J］.生物质化学工程，2009，43（1）：20-24.

［7］ZEITSCH K J.The chemistry and technology of furfural and its many by products［J］.Sugar Series，2000（13）：338-339.

［8］Rebecca A，Silverstein，Ye Chen，et al.comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks［J］.Bioresource Technology，2007，98（16）：3000 -3011.

［9］陈战国，周利燕，等.苯酚-硫酸法测定太白泡沙参总多糖的含量［J］.陕西师范大学学报，2009，37（4）：48-51.

Determination of trehalose content with enzyme electrode mothed

WANG Zi-hui1，CHU Jie2，*，WANG Jun-gao1，LIU Ke-chun2
（1.School of Food&Bioengineering，Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China；2.Biology Research Institute of Shandong Academy of Science，Jinan 250014，China）

The determination of trehalose content was preliminarily studied with enzyme electrode.Two different hydrolysis ways with sulfuric acid or hydrochloride were explored in this experiment.The results showed that the optimal reaction conditions were：hydrochloride hydrolysis at 5% concentration，100℃ and 5h，sulfuric acid hydrolysis at 10%concentration，100℃and 5h.After the hydrolysis，glucose content was determined with enzyme electrode and compared with phenol-sulfuric acid method.Determination of trehalose with enzyme electrode has largely eliminated the interference of impurities.lt is an ideal determination method more repetitively and accurately.

trehalose；acid；hydrolysis；enzyme electrode；biosensor

TS247

A

1002-0306（2010）11-0366-04

2009-12-14 *通讯联系人

王子辉（1985-），男，在读硕士研究生，研究方向：微生态制剂。