大叶藻中黄酮类物质提取工艺的研究

黄媛媛，张朝辉，李八方，赵 雪

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

大叶藻中黄酮类物质提取工艺的研究

黄媛媛，张朝辉，李八方，赵 雪

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

研究了大叶藻中黄酮的乙醇提取工艺，以大叶藻中黄酮提取率为考察指标，通过单因素和正交实验，考察提取温度、乙醇浓度、固液比、提取时间对黄酮提取率的影响，结果确定最佳提取工艺条件为：提取温度55℃，提取固液比1∶30，提取溶剂乙醇浓度85%，提取时间3h。在最佳提取条件下，提取率可高达1.80%。

大叶藻，黄酮，乙醇，正交实验

海草是一类生活在温带海域沿岸浅水中的单子叶草本植物。海草有发育良好的根状茎（水平方向的茎），叶片柔软、呈带状。目前中国记录有14种海草，如喜盐草、大叶藻等。大叶藻（Zostera marina L.），隶属于眼子菜科大叶藻属（Zostera L.），分布于我国河北和山东等沿海地区，朝鲜、日本、俄罗斯等地也有分布。大叶藻的叶子细长呈带状，长30～150cm，宽0.7～1.5cm，呈鲜艳绿色，春夏两季生长繁茂。黄酮类化合物是泛指具有两个酚羟基的苯环（A -与B-环）通过中央三碳原子相互联结而成的一系列化合物［1］。黄酮类化合物具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤、抗菌等，是茶及众多中草药如黄芩、银杏、沙棘等的活性成分。黄酮可以改善血液循环，降低胆固醇，向天果中的黄酮还含有一种PAF抗凝因子，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，改善心脑血管疾病的症状。黄酮类化合物具有抗氧化活性，主要表现在减少自由基的产生和清除自由基两个方面［2］，是延缓衰老的重要活性物质。目前国内尚未有从海草——大叶藻中提取黄酮类物质的研究报道，本研究的目的是从大叶藻中提取黄酮化合物，为进一步的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大叶藻 采于青岛栈桥附近，低温烘干后用捣碎机粉碎制成粉末；芦丁标准品 购于南京替斯艾么中药研究所；乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝均为分析纯。

FW100捣碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；A1204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-2102PC紫外可见分光光度计 龙尼柯（上海）仪器有限公司；量筒，容量瓶，剪刀等。

1.2 标准曲线的绘制［3］

准确称取10mg标准芦丁对照品，以95%乙醇溶液定容至50mL，摇匀即得浓度为0.2mg/mL标样储备液，准确移取0.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL芦丁标样储备液于6个25mL容量瓶中，分别加入0.3mL浓度为5%的NaNO2溶液，摇匀后静置6min，加入0.3mL浓度为10%的Al（NO3）3溶液，摇匀后静置6min，再加入2mL浓度为4%的NaOH溶液，摇匀，用95%乙醇定容至刻度，摇匀后静置15min。以95%乙醇为空白，用1cm比色皿，在400～600nm波长范围内，测得最大吸收波长，然后在最大吸收波长处分别测定不同浓度的芦丁标准品的吸光度。以吸光度Y对浓度X进行回归。计算回归方程和相关系数。

1.3 大叶藻中黄酮类物质提取的单因素实验

1.3.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响 在提取温度为室温20℃的条件下，选取料液比为1∶20，提取2h，做提取溶剂乙醇浓度的单因素实验。选取乙醇浓度为45%、55%、65%、75%、85%、95%。

1.3.2 提取时间对黄酮提取率的影响 在乙醇浓度为55%的条件下，选取料液比为1∶20，温度为20℃，做提取时间的单因素实验，选择时间为1、2、3、4、5、6h。

1.3.3 料液比对黄酮提取率的影响 在提取温度20℃、乙醇浓度55%、提取时间2h，做料液比的单因素实验，料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40。

1.3.4 温度对黄酮提取率的影响 在提取时间2h、乙醇浓度55%、料液比为1∶20的条件下，做提取温度的单因素实验。选择温度为 25、35、45、55、65、75℃。

1.3.5 黄酮提取率计算

式中：黄酮浓度，mg/mL；溶液体积，mL；原料质量，mg。

1.4 大叶藻中黄酮提取的正交实验

在以上的单因素实验的基础上，以乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比为因素设计正交实验，以确定大叶藻中黄酮的最佳提取工艺条件，因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 标准曲线

在400～600nm内测得芦丁标准品的最大吸收波长为500nm，在此波长下得到芦丁标准曲线，见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响 从图2可以看出，随着乙醇浓度的升高，黄酮提取率上升，乙醇浓度达到75%左右时，黄酮提取率达到最大值，而后随着乙醇浓度的增加黄酮提取率下降，这说明75%乙醇浓度是提取黄酮的最佳乙醇浓度。造成这种现象的主要原因是乙醇浓度不同，极性也不相同，75%乙醇的极性与大叶藻中黄酮的极性相似［4］，随着乙醇浓度的升高，一些脂溶性物质的溶出增加，影响了黄酮的浸出。

图2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.2.2 提取时间对黄酮提取率的影响 从图3可以看出，随着提取时间的延长，黄酮的提取率先上升后下降，在3h时达到最大值。原因是时间过短，黄酮物质还未充分溶出，时间在3h时，黄酮溶出已达平衡，再延长提取时间，一些热敏性组分被破坏或提取时间过长乙醇挥发导致浓度下降而使提取率下降。

图3 提取时间对黄酮提取率的影响

2.2.3 料液比对黄酮提取率的影响 从图4可以看出，随着料液比的增加，黄酮提取率在不断上升，但是随着料液比的增加，后续分离提纯的难度也越来越大，因此，在所做单因素实验中，料液比的最大值选择1∶40。

图4 提取料液比对黄酮提取率的影响

2.2.4 提取温度对黄酮提取率的影响 从图5可以看出，随着温度的升高，黄酮提取率在不断上升，在所选取的温度范围内，最高温度75℃，总黄酮的提取率达到最大。由于黄酮对温度的不稳定性，较高温度会对黄酮造成一定量的分解或是影响其活性，所以选取温度75℃为本实验黄酮的提取温度［5］。

2.3 正交实验

从表2的正交实验结果可知，大叶藻中黄酮的最佳提取工艺条件为：提取溶剂乙醇浓度为85%，提取时间3h，提取料液比为1∶30，提取温度55℃，在此条件下，提取率最高。各种因素对提取效果影响的主次顺序为：提取时间＞提取料液比＞提取温度＞提取溶剂乙醇的浓度；通过方差分析可知，料液比对提取率影响显著。

表3 方差分析

图5 提取温度对黄酮提取率的影响

表2 L16（45）正交实验设计及结果

3 结论

本文考察了影响大叶藻黄酮乙醇提取的各因素条件，通过单因素和正交实验确定了大叶藻黄酮的乙醇提取最佳工艺条件为：提取温度55℃，提取时间3h，乙醇浓度85%，料液比1∶30。在最佳提取条件下，提取率可达1.80%。将粗提取物经过二次结晶，会得到纯度极高的大叶藻黄酮制品。

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Extraction technology of flavonoids from Zostera marina L.

HUANG Yuan-yuan，ZHANG Zhao-hui，LI Ba-fang，ZHAO Xue
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The flavonoids were extracted from Zostera marina L.with ethanol.The quantity proportion of flavonoids extracted from Zostera marina L.was investigated.Some factors，such as extraction temperature，ethanol concentration，the ratio of solid to liquid，extracting time were studied as the main factors on the extracting quantity.The single factor and orthogonal experiments showed that the optimum extraction conditions were as follows：extracting temperature 55℃，the ratio of solid to liquid 1∶30，ethanol concentration 85%，extracting time 3 hours.Under the best condition，the extraction rate can be as high as 1.80%.

Zostera marina L.；flavonoids；ethanol extraction；orthogonal experiment

TS201.1

B

1002-0306（2010）11-0291-03

2009-11-16

黄媛媛（1986-），女，硕士，研究方向：海洋生物活性物质。

国家自然科学基金（30771674）；教育部重点项目（109099）。