响应而法优化CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII 木糖发酵产丁醇培养基的研究

刘 娅，刘宏娟，张建安，*，陈宗道

（1.西南大学食品学院，重庆400716；2.清华大学核能与新能源技术研究院，北京102201；3.石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

响应而法优化CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII 木糖发酵产丁醇培养基的研究

刘 娅1，2，3，刘宏娟2，张建安2，*，陈宗道1

（1.西南大学食品学院，重庆400716；2.清华大学核能与新能源技术研究院，北京102201；3.石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

采用响应面法对Clostridium beijerinckii利用木糖发酵生产丁醇的培养基进行了优化，建立了回归方程，得到了Cl.beijerinckii木糖发酵的优化培养基组成为：木糖26.6g/L，酵母浸粉1.38g/L，维生素液5.55mL/L，微量元素液9.67mL/L。在此优化条件下发酵，丁醇产量提高了18.4%，达到6.69g/L。

Clostridium beijerinckii，木糖，丁醇，培养基，响应面法

受世界石油资源价格、环保和全球气候变化的影响，发展生物燃料已成为许多国家提高能源安全、减排温室气体、应对气候变化的重要措施。生物丁醇以其能量密度高、腐蚀性小、对水的宽容度大、可以和汽油混合等许多优于生物乙醇之处而受到世界各国的广泛关注。传统的丁醇发酵工业以粮食为原料，生产成本高，随着世界粮食危机的加重，现代的生物丁醇产业必然转向价廉易得的木质纤维类原料，如农作物秸秆、废弃农产品、加工下脚料等非食用资源。由于木质纤维类原料水解后产生的糖类物质主要为木糖，因此，本文研究了以木糖为碳源Cl.beijerinckii的丁醇发酵，并利用响应面法对其培养基进行了优化，从而为Cl.beijerinckii以纤维素水解液为碳源发酵生产丁醇的研究提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

拜氏梭菌（Clostridium.beijerinckii） 实验室保藏菌种；种子培养基 酵母浸粉0.3%，牛肉膏1%，胰蛋白胨1%，可溶性淀粉0.1%，葡萄糖0.5%，L-半胱氨酸0.05%，NaCl 0.5%，NaAc 0.3%，pH8.5；斜面培养基 种子培养基另加琼脂2%；P2培养基 木糖，酵母粉，P2营养液。其中P2营养液组成为［9-10］：a.维生素液：对-氨基苯甲酸0.01%，硫胺素0.01%，生物素0.0001%；b.微量元素液：MgSO4·7H2O 2%，MnSO4·H2O 0.1%，FeSO4·7H2O 0.1%，NaCl 0.1%；c.缓冲液：KH2PO45%，K2HPO45%，NH4COOH 22%。接种前将缓冲液以0.5%比例加入P2培养基，维生素液和微量元素液按实验设计比例加入P2培养基中。

GC2010气相色谱、LC-20AD液相色谱 日本岛津公司；SPX-10013-2生化培养箱、SW-CJ-lF单人双面垂直洁净工作台 上海博迅实业有限公司；TG16-W微量高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养 从斜面培养基刮取菌落加入种子培养基，37℃ 静置培养18h左右，至培养液在600nm处吸光值达到2.0时（6×109cfu/mL），接入P2发酵培养基。

1.2.2 发酵培养 以10%接种量将种子培养液接入发酵培养基，37℃下静置培养72h后结束发酵，测定丁醇和木糖。

1.2.3 培养基的优化 以丁醇产量为指标，选择木糖、酵母浸粉、维生素液、微量元素液为影响因素，根据中心组合设计原理，设计4因素5水平共30个实验点的响应面分析实验，实验因素水平见表1。通过实验筛选木糖发酵生产丁醇的适宜培养基配比，研究因素间交互作用对丁醇产量的影响。用 Design Exprert软件（Version 7.0，Stat-Ease.Inc.，Minneapolis，MN.USA.）统计数据并描述响应面。

表1 旋转中心组合设计实验因素水平及其编码表

1.2.4 丁醇产量的测定 发酵液12000r/min离心10min，取上清液，与内标异丁醇混合后采用气相色谱仪进样检测。色谱柱为KB-5MS，25m×0.53mm× 1.00μm；检测器FID；进样口温度240℃；检测器温度260℃；柱温80℃（保温5min）～120℃（保温3min）；载气为N2，流速2.5mL/min。

2 结果与讨论

2.1 丁醇产量多元二次模型方程的建立及检验

根据前期实验结果，确定出影响丁醇产量的主要因素和添加量（表1），实验设计与结果见表2。响应面分析实验点为30个，其中6个为检验误差的零点实验，响应值Y为丁醇产量。

利用Design expert软件对表2实验数据进行二次多项回归拟合，得到Cl.beijerinckii对木糖、酵母浸粉、维生素以及微量元素的二次多项式回归方程为：

式中：Y1为丁醇产量的预测值，X1、X2、X3、X4分别为木糖、酵母浸粉、维生素液和微量元素液的编码值。回归方程的方差分析及模型可信度分析结果见表3。

由方程的方差分析结果（表3）可知，模型F值= 52.15827，概率（Pr＞F）值＜0.0001，非常显著，失拟项在α=0.05水平上不显著，表明模型拟合度很好。同时，一次项、平方项、交叉项均对响应值有显著性影响。回归方程确定系数R2=0.9736，说明模型可以解释97.36%实验所得丁醇产量的变化，表明模型与实际情况拟合较好。

表2 旋转中心组合设计及其实验结果表

表3 丁醇产量二次多项模型及其各项的方差分析表

2.3 丁醇产量响应面交互作用与优化

由回归方程作出响应曲面图（图1～图4）可较为直观地反映出各因素及其交互作用对响应值的影响。

图中每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用，此时第三个和第四个变量保持在最佳水平。由响应面图可知，木糖浓度和酵母浸粉浓度与丁醇产量存在极显著的相关性，维生素液和微量元素液与丁醇产量也存在显著的相关性。

图1 木糖和酵母浸粉对丁醇产量影响的响应面立体分析图（维生素液=10mL/L，微量元素液=10mL/L）

图2 木糖和维生素液对丁醇产量影响的响应面立体分析图（酵母浸粉=1g/L，微量元素液=10mL/L）

图3 木糖和微量元素液对丁醇产量影响的响应面立体分析图（酵母浸粉=1g/L，维生素液=10mL/L）

图4 酵母浸粉和维生素液对丁醇产量影响的响应面立体分析图（木糖=20g/L，微量元素液=10mL/L）

从图1可以看出，木糖和酵母浸粉交互作用极显著，当木糖浓度在10～26.6g/L范围内时，随着木糖浓度的增加，丁醇产量增加，但木糖浓度过高（大于26.6g/L），则会出现底物抑制作用使得丁醇产量下降；而酵母浸粉浓度增加时，丁醇产量先增加，然后有所下降，高浓度的酵母浸粉并不能促进丁醇产量的增加，只有其浓度在1.25～1.5g/L时，才可获得较高的丁醇产量。图2显示木糖和维生素液交互作用显著，维生素液添加量在3～7mL/L时，丁醇产量随木糖浓度的增加而显著增加，当添加量大于10mL/L时，丁醇产量增加不明显。图3表明，木糖和微量元素液交互作用不显著，微量元素液添加量在9～11mL/L时，丁醇产量随木糖浓度升高而有所增加，添加量大于11mL/L时，丁醇产量增加不明显。由图4可知，酵母浸粉和维生素液二者间也存在一定的交互作用，维生素液添加量在5～10mL/L时，丁醇产量随酵母浸粉浓度升高而增大，添加量大于10mL/L时，丁醇产量增加不明显。

通过对丁醇产量模型进行求导和解逆矩阵，可以得到模型的极值点，木糖为26.6g/L，酵母浸粉1.38g/L，维生素液添加量5.55mL/L，微量元素液添加量9.67mL/L，此时模型预测的最大响应值为6.61g/L。

2.3 验证实验

在上述优化条件下进行Cl.beijerinckii木糖发酵的培养基验证实验，分批次发酵（4次），丁醇产量平均值为6.69±0.42g/L，实验值与理论预测值非常接近，可见该模型可以较好地预测Cl.beijerinckii的实际发酵情况。

3 结论

可再生的木质纤维类资源也可作为发酵丁醇的底物，从而可降低生物丁醇的原料成本。因此，有必要对Cl.beijerinckii的木糖发酵情况进行研究。实验通过中心组合实验设计，建立了影响丁醇产量的二次多项式数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了内在因素水平，得出了木糖发酵制备生物丁醇的最佳培养基配方为木糖26.6g/L，酵母浸粉 1.38g/L，维生素液 5.55mL/L，微量元素液9.67mL/L。在最优化条件下经四次发酵培养基分批实验验证，预测值与验证实验平均值接近，与原始培养条件丁醇产量5.65g/L相比，丁醇产量提高了18.38%，达到6.69g/L。

［1］刘娅，刘宏娟，张建安，等.新型生物燃料——丁醇的研究进展［J］.现代化工，2008，28（6）：28-32.

［2］黄丽金，陆兆新，袁勇军.响应面法优化德氏乳杆菌保加利亚亚种增殖培养基［J］.食品科学，2005，26（5）：103-107.

［3］王铁男，韩建春.响应面法优化固态发酵生产γ-多聚谷氨酸［J］.食品工业科技，2008，29（3）：177-179.

［4］潘春梅，樊耀亭，赵攀.发酵法产氢培养基的响应面分析优化［J］.中国农学通报，2008，24（1）：38-44.

［5］Benoit Faucon BP，ABF and DuPont to Build Biofuel Plant.Wall Street Journal（Eastern edition）［N］.New York，2007-06-28（A9）.

［6］Ezeji TC，Qureshi N，，Blaschek，HP.Bioproduction of butanol from biomass：from genes to bioreactors［J］.Current Opinion in Biotechnology，2007，18：1-8.

［7］杨德著.实验设计与分析［M］.北京：中国农业出版社，2002.

Optimization of biobutanol production strain Costridiuml beijerinckii with xylose medium by response surface methodology

LIU Ya1，2，3，LIU Hong-juan2，ZHANG Jian-an2，*，CHEN Zong-dao1
（1.Food College，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Institute of Nuclear and New Energy Technology，Tsinghua University，Beijing 102201，China；3.Food College，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Response surface method was used to optimize the fermentation medium of butanol production by Clostridiuml beijerinckii with xylose as the carbon resource.A regression equation was established and the optimal medium contained xylose 26.6g/L，yeast extract 1.38g/L，solution of vitamin 5.55mL/L and solution of mineral 9.67mL/L.Under this condition，the butanol concentration increased 18.4%than that of the control and the butanol concentration reached 6.69g/L.

Clostridium beijerinckii；xylose；biobutanol；medium；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2010）07-0194-03

2009-07-14 *通讯联系人

刘娅（1974-），女，在读博士，副教授，研究方向：食品生物技术。