莠去津对雌性日本沼虾的毒性作用

张晗,沈丹丹,穆淑梅,郭明申,康现江

(河北大学生命科学学院,河北保定 071002)

莠去津对雌性日本沼虾的毒性作用

张晗,沈丹丹,穆淑梅,郭明申,康现江

(河北大学生命科学学院,河北保定 071002)

研究莠去津对雌性日本沼虾的生殖毒性,为其养殖水体水质管理提供依据.以概率作图法计算日本沼虾24,48,72和96 h的半致死质量浓度,并观察各暴露组卵巢组织结构的变化.通过胁迫实验,研究莠去津对暴露4 d和8 d的日本沼虾卵巢乳酸脱氢酶(LDH)比活力的影响.结果表明:22℃时,莠去津对雌性日本沼虾24,48,72和96 h的半致死质量浓度分别为134.23,90.24,52.57和46.36 mg/L,安全质量浓度为4.64 mg/L;卵巢急性毒性实验切片显示,随莠去津质量浓度的增大,卵母细胞间隙增大,胞体膨大、变形.胁迫实验表明,低质量浓度莠去津在短时间内对卵巢LD H活力有诱导作用,当质量浓度高于0.46 m g/L时,LD H活力明显受到抑制.本研究提示,莠去津对雌性日本沼虾具有生殖毒性作用.

莠去津;半致死质量浓度;乳酸脱氢酶比活力;卵巢;日本沼虾

莠去津(atrazine),又名阿特拉津,化学名为2-氯-4-乙胺基-6-异丙氨基-1,3,5-三嗪,是一种选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂[1].因价格低廉,在土壤中保留时间长被广泛用于农业生产[2].但同期环境毒理学研究表明,莠去津具有内分泌干扰作用,并于1997年被世界野生动物基金会(WWF)列为环境荷尔蒙物质[3],因此莠去津对养殖水体具有潜在的影响.目前,有关莠去津的毒性研究多见于大鼠[2,4]、小鼠[5]、斑马鱼[1,6]、鲫鱼[7-9]等,而对淡水虾的毒性研究尚未见报道.日本沼虾(Macrobrachiumnipponense),俗称青虾或河虾,隶属甲壳纲,十足目,长臂虾科,其肉质鲜美,营养丰富,是我国重要的淡水虾之一.本研究以雌性日本沼虾为实验对象,分析水体中莠去津的毒性作用,旨在为我国水产养殖与水质管理提供依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

日本沼虾于2009年5月购自河北省安新县白洋淀水产市场.挑选出雌虾,置于水族箱暂养7 d.取体色正常、大小均匀、反应灵敏的成熟雌性个体作为实验用虾,平均体长为(3.67±0.30)cm,平均体重为(1.58±0.08)g.暂养期间充气泵24 h不间断充气,养殖用水为曝气1周的去氯自来水,水温为(22±2)℃,溶解氧大于5 mg/L,每天定时投喂2次干饲料.暂养期间无虾死亡.

1.2 实验方法

1.2.1 莠去津的配制

将莠去津(济南科赛基农有限公司,质量分数为95%)溶于二甲基亚砜,配制成质量浓度为183.0 mg/m L的母液,暴露时稀释成所需质量浓度,二甲基亚砜的终体积分数小于0.5‰.

1.2.2 急性毒性实验

将雌性日本沼虾随机分为6个不同质量浓度莠去津暴露组、溶剂对照组和空白对照组.根据预实验结果,莠去津暴露组的质量浓度分别为25.0,32.0,42.3,54.9,71.4和91.5 mg/L,溶剂对照组的二甲基亚砜体积分数为0.5‰,每组设3个平行.实验在35.5 cm×15.5 cm×15.0 cm的玻璃缸中进行,每缸随机放10尾虾,水量为6 L.实验期间不投饵,保持连续微充气.实验过程中每24 h观察并记录虾的中毒症状,去除死亡个体,实验暴露96 h.根据存活情况以概率作图法计算莠去津24,48,72和96 h的半致死质量浓度.根据公式ρ=0.1x计算莠去津对日本沼虾的安全质量浓度[10],其中x为日本沼虾96 h的半致死质量浓度.

1.2.3 卵巢组织结构观察

96 h实验结束后,选取急性毒性实验中各组存活的虾,冰上麻醉后,迅速取出卵巢,放入Bouin's固定液中固定24 h.常规6μm厚石蜡切片,HE染色,Olympus BX51观察拍照记录.

1.2.4 胁迫实验

为保证实验期间药物对虾的安全性,根据急性毒性实验结果,莠去津的实验质量浓度设在安全质量浓度之内.实验在35.5 cm×15.5 cm×15.0 cm的玻璃缸中进行,每缸随机放10尾虾,水量为6 L.莠去津的质量浓度分别为0,0.10,0.23,0.46,2.32和4.64 mg/L,每组设3个平行,实验期间保持连续微充气,无虾死亡.

1.2.5 LD H比活力测定

分别于4 d和8 d称取不同质量浓度莠去津胁迫下的虾卵巢组织0.1～0.3 g,置于离心管中,加入4倍体积4℃预冷的10 mmo l/L,p H 6.5的KH2PO4-K2HPO4缓冲液.将组织剪成悬粒状后进行超声波细胞粉碎(工作时间10 s,间隔时间4 s,连续工作5次).匀浆液于4℃高速冷冻离心机中以8 000 r/m in离心20 min,取上清液用于蛋白含量测定和LDH比活力测定.

LDH活力测定以丙酮酸为底物,采用紫外分光光度法[11].蛋白含量测定以牛血清白蛋白作为标准溶液,采用考马斯亮蓝法[11].

1.3 数据统计分析

统计结果采用(平均值±标准差)表示,各统计结果均采用SPSS 12.0进行分析.单因素方差分析采用One-Way ANOVA模块,组间比较采用SN K法.M icrosof t Office Excel 2003用于图表制作.

2 结果

2.1 莠去津对雌性日本沼虾的急性毒性

不同质量浓度莠去津对雌性日本沼虾的急性毒性作用如表1所示.当莠去津的质量浓度为25.0 m g/L时,实验期间无虾死亡.随莠去津质量浓度增加,各时间段死亡率均呈上升趋势;相同质量浓度莠去津暴露组的死亡率随实验时间的延长而增加;至莠去津的质量浓度为91.5 mg/L时,24 h即无存活虾.

表1 不同质量浓度莠去津对雌性日本沼虾死亡率的影响Tab.1 Effect of atrazine with differentmass concentrationson mortality rate of female M.nip ponense

根据莠去津质量浓度以及相应的24～96 h受试虾死亡率作回归分析,可得到24,48,72和96 h雌性日本沼虾死亡率y与莠去津质量浓度对数x之间的线性回归方程和半致死质量浓度,如表2所示.根据96 h的半致死质量浓度,莠去津对雌性日本沼虾的安全质量浓度为4.64 mg/L.

表2 雌性日本沼虾死亡率y与莠去津质量浓度对数x间的相关方程Tab.2 Correlation equation between mortality rate(y)and atrazinemass concentration logarithm(x)of female M.nip ponense

2.2 莠去津对日本沼虾卵巢组织结构的影响

光学显微镜下观察,空白对照组与溶剂对照组个体的卵巢组织结构正常,卵母细胞排列紧密,胞体较大,呈卵圆形,胞核较大,清晰可见(图1 a).随莠去津质量浓度增加,卵巢组织结构出现不同程度异常.当莠去津质量浓度为32.0 m g/L时,卵母细胞间出现间隙,排列不规则,卵母细胞胞体略有膨胀,出现轻微变形(图1 b);当莠去津质量浓度为54.9 mg/L时,卵母细胞间隙增大,胞体膨胀加剧,细胞变形(图1 c);至莠去津质量浓度达71.4 m g/L时,卵巢的组织结构呈现明显异常,卵母细胞排列混乱,胞体明显变形(图1 d).实验结束时,91.5 mg/L质量浓度组已无存活个体,故未进行卵巢组织结构观察.

图1 莠去津对日本沼虾卵巢组织结构的影响Fig.1 Effect of atrazine on histological structure of M.nip ponense ovary

图2 莠去津对日本沼虾卵巢LDH比活力的影响Fig.2 Effect of atrazine on LDH specif ic activity of female M.nipponense ovary

2.3 莠去津对日本沼虾卵巢LDH比活力的影响

如图2所示,莠去津对日本沼虾卵巢LDH比活力的影响与质量浓度和暴露时间有关.当莠去津的质量浓度较低时,LDH比活力与暴露时间相关.暴露4 d的受试虾卵巢LDH比活力受到诱导而增强,在0.23 m g/L质量浓度下酶活力最强(p<0.05),而暴露8 d的受试虾卵巢LDH比活力在0.10 m g/L质量浓度下受到抑制(p<0.05),在0.23 m g/L时酶活力无显著变化(p>0.05);当莠去津质量浓度高于0.46 mg/L时,暴露4 d和暴露8 d的LDH比活力均受到抑制,且当质量浓度高于2.32 m g/L时,暴露8 d的受试虾卵巢LDH比活力显著低于4 d(p<0.05).

3 讨论

3.1 莠去津对日本沼虾的急性毒性

作用

急性毒性实验能够测试莠去津对日本沼虾的半致死质量浓度和安全质量浓度,预测和预防莠去津对受纳水体中虾的急性损伤,并为深入研究该物质的毒性作用机理提供基础资料.本研究表明,莠去津对雌性日本沼虾96 h的半致死质量浓度为46.36 mg/L,安全质量浓度为4.64 m g/L.孟顺龙等[12]研究发现,莠去津对麦穗鱼96 h的半致死质量浓度为41.64 mg/L,安全质量浓度为4.16 mg/L,本研究结果与此相似;而陈家长等[10]对鲫鱼的研究发现,莠去津对鲫鱼96 h的半致死质量浓度为105.94 mg/L,安全质量浓度为10.59 mg/L.这表明日本沼虾对莠去津的敏感度与麦穗鱼相似,而高于鲫鱼.作者认为该现象可能与物种本身的特性有关.根据农药毒性分级标准[13],莠去津对日本沼虾为低毒农药.3.2 莠去津对日本沼虾卵巢的影响

燕飞等[14]对正常养殖条件下日本沼虾卵巢的发育特征进行了详细报道.本研究在此基础上观察了急性毒性条件下莠去津对日本沼虾卵巢组织结构的影响,结果显示,随莠去津质量浓度增大,卵细胞间隙增大,胞体膨大、变形.该现象表明高质量浓度(≥42.3 mg/L)莠去津可导致日本沼虾卵巢组织结构发生病理改变,从而抑制其生殖功能.研究表明,莠去津可使体外培养的仓鼠卵巢细胞染色体断裂[15],大鼠卵巢细胞分裂和增殖减慢[16].低剂量长时间莠去津作用对日本沼虾卵巢的潜在毒性影响有待深入研究.

LDH是细胞内糖酵解中的一种重要限速酶,可催化乳酸氧化成丙酮酸,从而完成葡萄糖的无氧酵解过程.卵巢组织LDH比活力可反映出卵巢的代谢状况,对评价机体的健康状况具有重要意义.本胁迫实验显示,低质量浓度莠去津在短时间内对卵巢LDH活力有诱导作用,当质量浓度高于0.46 mg/L时,LDH活力明显受到抑制,且呈剂量-效应负相关.虽然本胁迫实验的质量浓度在安全质量浓度之内,但在莠去津长期存在状况下仍可能对卵巢细胞造成慢性毒性损伤,影响其正常生理功能,使LDH活性降低.

综上所述,在22℃时,莠去津对雌性日本沼虾96 h的半致死质量浓度为46.36 mg/L,安全质量浓度为4.64 mg/L.莠去津对雌性日本沼虾具有低毒性作用并可影响其生殖能力.

[1]孟昭璐,刘皓慈,戎奕,等.阿特拉津对斑马鱼影响的研究[J].职业与健康,2008,24(3):205-208.

[2]RA YNER J L,ENOCH R R,FENTON S E.Adverse effects of prenatal exposure to atrazine during a critical period of mammary gland grow th[J].Toxicological Sciences,2005,87(1):255-266.

[3]齐文启,孙宗光,汪志国,等.环境荷尔蒙研究的现状及其监测分析[J].现代科学仪器,2000(4):32-38.

[4]栾新红,丁鉴峰,刘梅,等.除草剂阿特拉津对大白鼠血清中雌二醇(E2)浓度的影响[J].沈阳农业大学学报,2003,34(2):110-112.

[5]穆洪,张平,徐建.绿麦隆与阿特拉津对小鼠毒性作用[J].中国公共卫生,2006,22(8):990-991.

[6]逯娟,李凤超,穆淑梅,等.莠去津对斑马鱼胚胎发育及幼鱼成活的影响[J].安徽农业科学,2009,37(2):625-626.

[7]刘浩华,伊雄海,陆贻通.内分泌干扰物莠去津对鲫鱼血清激素的影响[J].生态毒理学报,2007,2(2):184-189.

[8]孟顺龙,陈家长,胡庚东,等.低浓度阿特拉津对鲫鱼超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响[J].农业环境科学学报,2007,26(1):170-174.

[9]陈家长,孟顺龙,胡庚东,等.低浓度阿特拉津对鲫鱼过氧化氢酶(CA T)活性的影响[J].农业环境科学学报,2008,27(3):1151-1156.

[10]陈家长,孟顺龙,胡庚东,等.阿特拉津对雄性鲫鱼血清雌二醇含量的影响[J].生态学杂志,2007,26(7):1068-1073.

[11]张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术[M].2版.北京:高等教育出版社,1997.

[12]孟顺龙,陈家长,冷春梅.除草剂阿特拉津与丁草胺对麦穗鱼的联合毒性研究[J].环境污染与防治,2007,29(4):254-256,260.

[13]陈维新.农业环境保护[M].北京:中国农业出版社,2001.

[14]燕飞,李彦芹,康现江,等.日本沼虾卵巢发育特征及其蛋白质的变化[J].河北大学学报:自然科学版,2001,21(4):411-414

[15]GRUESSNER B,WA TZIN M C.Patterns of herbicide contamination in selected Vermont stream s detected by enzyme immunoassay and gas chromatography/mass spectrometry[J].Environmental Science&Technology,1995,29(11):2806-2813.

[16]栾新红,丁鉴峰,孙长勉,等.除草剂阿特拉津影响大鼠脏器功能的毒理学研究[J].沈阳农业大学学报,2003,34(6):441-445.

(责任编辑:赵藏赏)

Toxic Effect of Atrazine on Female M acrobrachium nip ponense

ZHANGHan,SHEN Dan-dan,MU Shu-mei,GUO Ming-shen,KANG Xian-jiang
(Co llege of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

Rep roductive toxic effects of atrazine on femaleMacrobrachiumnipponensew ere studied to p rovide evidence fo r the water quality management of aquaculture.Semi-lethal mass concentrations of atrazine toM.nipponenseat 24,48,72 and 96 h w ere calculated by p robability m apping.The changes of ovarian tissue structure in each exposure group were observed.Ovarian lactate dehyd rogenase(LDH)specific activity at the atrazine exposure of 4 days and 8 days was detected by stress experiment.The results showed that the semi-lethal mass concentration of atrazine toM.nipponenseat 24,48,72 and 96 h at 22℃w ere 134.23,90.24,52.57 and 46.36 m g/L,respectively,and the safe mass concentration w as 4.64 mg/L.The ovarian sections in acute toxicity test show ed that the intercellular space of oocytes increased and the cell bodies enlarged and deformed w ith the increase of the mass concentration of atrazine.The stress experiment demonstrated that atrazine at a low mass concentration increased ovarian LDH specific activity in a sho rt time.How ever,atrazine at the mass concentration above 0.46 m g/L inhibited the ovarian LDH specific activity obviously.The study indicated that atrazine had the rep roductive toxic effects on femaleM.nipponense.

atrazine;semi-lethal mass concentration;LDH specific activity;ovary;Macrobrachium nipponense

S 966.12;S 917.4

A

1000-1565(2010)06-0701-05

2009-11-02

河北大学引进人才博士基金资助项目(2009-176)

张晗(1978—),女,内蒙古包头人,河北大学讲师,主要从事水生动物发育生物学研究.

康现江(1964—),男,河北邯郸人,河北大学教授,博士生导师,主要从事水生动物生殖生物学研究.