肝细胞癌组织中环氧合酶-2与p16的表达及相关性

沈 波,刘宁波,彭 韬,冷 静

(1.江苏省南京明基医院病理科,江苏南京,210019;2.南京医科大学 病理系,江苏南京,210029)

近年来人们发现长期服用阿司匹林可以降低消化道肿瘤的发病率。研究显示阿司匹林作用的靶分子-环氧合酶-2(COX-2)在一些肿瘤中表达升高,并认为COX-2可促进肿瘤发生发展。为此作者选择江苏省人民医院10例手术切除的原发性肝细胞癌(HCC)组织,观察了肝细胞癌组织中COX-2的表达状况,并探讨肝细胞癌发生发展机理中COX-2表达和p16蛋白的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选择江苏省人民医院手术切除原发性肝细胞癌(HCC)石蜡包埋标本10例,组织类型均为高中分化型。

1.2 检测试剂

COX-2单克隆抗体购自Cayman公司,p16单克隆抗体购自福州迈新公司。免疫组化二步法试剂盒购自美国DAKO公司。

1.3 实验方法

采用Envision二步法免疫组织化学染色。将甲醛固定、石蜡包埋的上述肿瘤组织4 μ m连续切片,常规脱蜡、水化,PBS(PH7.4,下同)洗5 min。1%H2O2室温封闭10 min,阻断内源性过氧化酶,PBS洗2次,每次5 min。微波处理抗原修复20 min,PBS洗2次,每次5 min。每张切片滴加50 μ L一抗,4 ℃过夜,PBS洗2次,每次5 min。每张切片滴加50 μ L二抗,37℃孵育45 min,PBS洗2次,每次5 min。PBS洗 2次后加显色液,显微镜下随时观察显色反应,至阳性显色较强而背景不显色,苏木素衬染、透明,中性树胶封片。用已知阳性切片作对照。用Leica RX250型图像分析系统采集图像,每个标本随机抽取5个高倍视野(×400),Qwin软件识别阳性表达面积百分比,取其均值。

1.4 结果判断

COX-2阳性表达的标准为:被测细胞胞质出现明显棕黄色颗粒者为阳性细胞,阳性细胞≥10%者判为阳性结果,<10%者判为阴性结果[1]。P16阳性表达的标准为:被测细胞胞质出现明显棕黄色颗粒者为阳性细胞,阳性细胞≥10%者判为阳性结果,<10%者判为阴性结果。

2 结 果

2.1 COX-2、P16的表达

COX-2在肝细胞癌中过表达,而P16在肝细胞癌中低表达。肝癌组织和癌旁组织中COX-2阳性表达率、COX-2阳性面积百分比、P16阳性表达率、P16阳性面积百分比差异均有统计学意义(P<0.05),具体数值见表1。

表1 肝癌组织及癌旁组织中的C OX-2、P16阳性表达率(%)及阳性面积百分比(%)

2.2 COX-2与P16的相关性

COX-2阳性组中P16阳性表达率10%(1/10),COX-2阴性组中P16阳性表达率为70%(7/10),2者之间差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织中COX-2与P16蛋白阳性面积百分比之间有负相关性(P<0.05)。

3 讨 论

环氧合酶有3种基因型:结构性COX-1,诱导性COX-2和新发现的COX-3。COX-2可被多种因素诱导,在炎症细胞中表达。近年来的研究表明,COX-2不仅是炎症反应的重要环节,而且在很多肿瘤组织中表达上调,由COX-2催化合成的PGE2是诱发肿瘤细胞增殖的重要原因。Leng J等[2]研究发现,使用外源性PGE2处理或将含重组COX-2基因的质粒转染多种肝细胞癌细胞株能明显促进肿瘤细胞的增殖;将反义COX-2质粒转染上述肿瘤则可抑制细胞增殖。

P16属于细胞周期蛋白激酶抑制蛋白(CDKI),参与细胞G1期进入S期的负调控,可防止细胞过度增殖和恶性变,其作用机制是抑制CDK的活性,阻断Rb的磷酸化,使细胞停滞于G1期,进而促使细胞发生分化,或者促使细胞发生凋亡,或者使细胞进入静止期。Matsuda Y等[3]、Qin Y等[4]研究表明P16基因在原发性肝细胞癌中表达缺失。程剑等[5]、周梅芳等[6]将含重组P16基因的质粒转染SMMC-7721肝细胞癌株能诱导肿瘤细胞凋亡。

COX-2导致肿瘤的发生可能是通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡实现的。刘宁波等[7]使用COX-2抑制剂celecoxib能抑制肝癌细胞增生,促进肝癌细胞凋亡。目前,COX-2与P16的相关性研究甚少,且并不一致。翟俊山等[8]发现在胃癌组织中COX-2和P16存在负相关性。Ruibal A等[9]发现在非小细胞肺癌中COX-2与P16存在正相关性。Xigui Yang等[10]在非霍奇金淋巴瘤中发现COX-2和P16无相关性。在肝癌组织中尚未见COX-2与P16相关性文献。作者的研究发现10例肝癌组织中COX-2过表达,P16低表达,COX-2和P16表达水平有负相关性。提示COX-2有可能通过减少P16的合成量,从而促进肝癌细胞增殖和恶性变。

[1]吴高松,邸 方,邹声泉.环氧合酶在肝细胞癌中的表达及其临床意义[J].华中科技大学学报,2002,31(6):653.

[2]Leng J,Han C,Demetris A J,et al.Cyclooxygenase-2 promotes hepatocellular carcinoma cell growth through Akt activation:evidence for Akt inhibition in celecoxib-induced apptosis[J].Hepatology,2003,38(3):756.

[3]Matsuda Y,Ichida T,Genda T,et al.Loss of p16 contributes to p27 sequestration by cyclin D(1)-cyclin-dependent kinase 4 complexes and poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(9):3389.

[4]Qin Y,Liu J Y,Li B,et al.Association of low p16INK4a and p15INK4b mRNAs expression with their CpG islands methylation with human hepatocellular carcinogenesis[J].World J Gastroenterol,2004,10(9):1276.

[5]程 剑,冯振卿,苏长青.重组腺病毒载体转染 p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用[J].南京医科大学学报,2003,24(4):361.

[6]周梅芳,林 彬,朱杰敏,等.靶向肝癌表达p16基因的腺病毒载体对裸鼠移植瘤的抗癌活性[J].南京医科大学学报,2008,28(2):166.

[7]刘宁波,彭 韬,沈 波,等.选择性抑制剂Celecoxib诱导肝癌细胞凋亡及相关分子机制的研究试验[J].南京医科大学学报,2004,24(4):321.

[8]翟俊山,李 楠,张 林,等.胃癌组织中P16,C-MYC和COX-2的表达及其与患者预后的关系[J].浙江中医药大学学报,2009,33(3):321.

[9]Ruibal A,Abdulkader I,Gude F,et al.T he immunohistochemical expression of cyclooxygenase 2 is inversely associated with(18)F-FDG-PET SUV values in non-small-cell lung cancers[J].Rev Esp Med Nucl,2009,28(1):11.

[10]Xigui Yang,Huazhi Zhang,Ling Wei,et al.COX-2及P16在非霍奇金淋巴瘤中的表达及临床意义[J].中德临床肿瘤学杂志(英文版),2009,8(2):104.