紫皮豇豆(VIGNA UNGUICULATA L.)花色苷的研究

高华杰,李雨菲,刚永运,何洪巨

(1.首都师范大学生命科学学院,北京 100048;2.北京师范大学附属实验中学,北京 100032; 3.国家蔬菜工程技术研究中心,北京 100097)

紫皮豇豆(VIGNA UNGUICULATA L.)花色苷的研究

高华杰1,李雨菲2,刚永运2,何洪巨3,＊

(1.首都师范大学生命科学学院,北京 100048;2.北京师范大学附属实验中学,北京 100032; 3.国家蔬菜工程技术研究中心,北京 100097)

首次应用高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用技术(HPLC-DAD-MS)鉴定出紫皮豇豆主要含有三种花色苷,分别为飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素的葡萄糖苷,其中矢车菊葡萄糖苷相对百分含量达到 93.4%;应用 pH示差法测定出其单体花色苷的含量为 57.15mg/100g鲜重;应用DPPH法测定结果显示,花色苷粗提液有较强的抗氧化能力。

紫皮豇豆,花色苷,抗氧化性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫皮架豇豆(J1、J58、J229) 于 2008年 7月 31号采自北京市延庆农场;盐酸、甲醇、乙醇、磷酸氢二钠、氯化钾、乙酸乙酯、三氟乙酸 (TFA) 均为分析纯;乙腈 色谱纯。

离心机 飞鸽牌,TDL-40B;HJ-3恒温磁力搅拌器 江苏金坛医疗仪器厂;电子天平 Sartorius BS210S;紫外分光光度仪 H ITACH I U-3410;高效液相色谱-质谱联用仪 岛津公司：DGU-20A5脱气机 Degasser;LC-20AD高压泵 Pump;S IL-20A自动进样器 Auto SamLpler;CBM-20A色谱工作站Communications BusModule;SPD-20A紫外 /可见光检测器 UV/V IS Detector;CT O-20A柱温箱Column Oven;组织捣碎机,真空泵,布氏漏斗, millipore制水机。

1.2 实验方法

1.2.1 紫皮豇豆花色苷粗提液的制备 将收获的紫皮豇豆洗净晾干,切碎,准确称取 30g置于组织捣碎机里磨碎,加入酸化甲醇 (v/v=1%),置于 4℃冰箱中1h,用布氏漏斗抽滤,滤液转移到500mL的容量瓶中,滤渣则加入酸化甲醇 (v/v=1%),置于冰箱中再静置 1h,再次抽滤。重复提取,直到滤液为无色时止,将滤液合并,定容至 500mL,置于 4℃冰箱中保存,待后续实验使用。

1.2.2 紫皮豇豆单体花色苷含量的测定 准确量取等体积的花色苷粗提液两份,分别旋转蒸发去掉溶剂,一份用pH1.0的缓冲液溶解,一份用 pH4.5的缓冲液溶解,静置 2h后测定,测定原理及方法参照文献[8]。

1.2.3 紫皮豇豆花色苷种类的鉴定 紫皮豇豆花色苷溶液的纯化方法与文献[9]相同。

花色苷分离鉴定所用的仪器是岛津公司生产LCMS-IT-TOF,色谱分离所用的色谱柱为：150× 4.6mm i.d.,5UMSS Wakosil C18,柱温为 32℃,流动相由A液(0.1%TFA-水溶液)和B液(0.1%TFA-乙腈溶液)组成。洗脱梯度为 0.01min 10%B,0.01～2min 10%B,2～30min 20%B,30～40min 30%B;流速为1.2mL/min。二极管阵列检测器的扫描波长范围是250～600nm。

质谱参数：雾化气流速 1.5L/min,曲形脱溶剂管温度为 200℃,检测电压为 1.75kV,扫描对象为质荷比为 200～1500的正离子。

1.3 花色苷的抗氧化能力测定

测定原理与方法参考文献 [10],略有改动。如表 1所示加样,用力摇匀,静置 30min后,加入 1cm比色皿中进行吸光度的测定,测出 A0、Ai、Aj的吸光度值,按下列公式 1进行清除率的计算,运用 Origin8软件作图并找出半抑制率浓度 (I C50)。

式中：A0-未加提取液的 DPPH·溶液的吸光度,以甲醇作空白;Ai-加入提取液后的DPPH·溶液的吸光度,以甲醇作空白;Aj-提取液与提取剂混合后的吸光度,以甲醇作空白。

表1 清除DPPH·实验设计

2 结果与讨论

2.1 紫皮豇豆中花色苷的含量

pH示差法被用于测定花色苷的含量,是基于花色苷溶液的颜色随着 pH的变化发生可逆性的改变,在 pH为 1时主要以有颜色的形式存在,在 pH为 4.5时主要以无色形式存在,这两种 pH的色素溶液在520nm下的吸光度的差别,与色素的浓度成比例[8]。矢车菊葡萄糖苷是植物中存在最广的单体花色苷[7],所以以它作为标准来表达单体花色苷的总量。而多聚花青素降解后形成的单体花青素,其颜色不会随着 pH的变化而变化,它们在 pH为 1和 pH为 4.5时的吸光率是相同的,这样就消除了花色苷粗提液中常常混有的多聚花青素对实验结果的干扰。

表 2 三种紫皮豇豆花色苷含量(mg/100g FW)

由表 2可知,紫皮豇豆 J58的含量高于另外两种紫皮豇豆的含量,与文献中报道[12]的一些水果蔬菜的花色苷含量 (黑豆花色苷含量为 44.5mg/100g,紫洋葱为 48.5mg/100g)比较,J58中花色苷的含量也是比较高的,因此,紫皮豇豆尤其是 J58可作为花色苷的一个重要来源。

2.2 紫皮豇豆花色苷种类鉴定

紫皮豇豆花色苷种类由对 HPLC-DAD-T OF MS生成的谱图分析,结合出峰顺序,参照相关文献鉴定得出。由图 1～图 4可知,J58的主要物质峰有三个,其中二号峰为主峰,积分面积最大,此外还有两个明显的小峰,在一号峰与二号峰之间还有一些更小的峰,但由于其含量太低,超出仪器的最低检测限,故不在本次检测范围内。由表 3可知,二号峰的面积占总积分面积的 93.4%,一号峰占 5.1%,三号峰占1.5%;二号峰的纯度达到 98%,其光谱图显示,可见光区最大吸收峰为515nm,该峰的质谱数据显示分子离子质荷比为 449,碎片离子质荷比是 287,与文献[13]对照可知,该峰代表的物质可能是矢车菊-3-葡萄糖苷 (cyanidin3-O-glucoside);一号峰分子离子质荷比、碎片离子质荷比分别是 465、303,可见光区最大吸收波长是 523nm,与文献[14]比较可知,该峰代表的物质可能是飞燕草 3-葡萄糖苷 (delphinidin 3-O-glucoside);三号峰分子离子质荷比、碎片离子质荷比分别是 433、271,可见光区最大吸收波长为500nm,低的最大吸收波长及质谱数据显示该峰代表的物质一定是天竺葵色素的糖苷化合物,即天竺葵3-葡萄糖苷 (pelargornidin 3-O-glucoside)[15]。

表 3 紫皮豇豆花色苷色谱和质谱数据

图1 紫皮豇豆花色苷色谱图

图2 紫皮豇豆二号峰的光谱图

图 3 紫皮豇豆花色苷二号峰的一级质谱图

图 4 紫皮豇豆花色苷二号峰的二级质谱图

2.3 花色苷粗提液抗氧化性研究

本实验用DPPH法来评价紫皮豇豆花色苷的抗氧化能力,以VC、BHT作为参照。I C50是抗氧化剂对DPPH的清除率达到 50%时抗氧化剂的浓度,浓度越低说明该抗氧化剂的抗氧化能力越强。由表 4可知,3.6177mg/mL紫皮架豇豆就清除自由基能力理论上来说相当与 0.0157mg/mL VC,可见紫皮架豇豆是值得推荐的有较强抗氧化能力的蔬菜。

图5 不同浓度的花色苷溶液对DPPH·的清除率

表4 不同材料对DPPH·的半抑制率浓度

3 结论

结果表明,紫皮豇豆荚果花色苷含量较高,所含花色苷以矢车菊 3-葡萄糖苷为主,除了三种含量高的花色苷得到鉴定外,还有几个峰由于含量低没有得到鉴定,有待进一步研究;花色苷粗提液中有许多杂质对花色苷起到辅色作用,这些杂质有待鉴定,从而有助于研究花色苷同别的物质之间的关系,这对提高花色苷稳定性的研究及应用有巨大价值;本文只用DPPH法测定了花色苷的抗氧化性,由于方法的选择也会对结果造成一定的影响,应该尝试多用几种方法来测定,通过不同方法间的比较以减少方法造成的误差,这一点也是值得进一步研究的地方。

从天然植物中寻找有效的抗氧化成分应用于医药、化妆品、食品、保健品之中是当前研究的热点之一,而花色苷不仅可作为抗氧化剂,更是优良的食品着色剂,这使得近年来花色苷的研究越来越受到重视。紫皮豇豆纤维素含量少,花色苷含量比较高,所以既是优良的保健蔬菜又可作为花色苷的来源,研究和应用前景广阔。

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Study on anthocyanins in purple cowpea(Vigna unguiculata L.)

GAO Hua-jie1,L IYu-fei2,GANG Yong-yun2,HE Hong-ju3,＊
(1.College ofLife Sciences,CapitalNor malUniversity,Beijing 100048,China; 2.The Exper imental High SchoolAttach to BeijingNor malUniversity,Beijing 100032,China; 3.National Engineering Research Center forVegetables,Beijing 100097,China)

Purp le cowp eas(Vigna unguicula ta L.)we re extrac ted w ith of0.1%HC l in m e thanol solution,p urified on a C-18solid ca rtridge,quantified by the pH d iffe rentia l m e thod,and cha rac te rized by m eans of HPLC-DAD-IT/ TO FMS ana lys is for the firs t t im e.Antioxidant ac tivity of extrac ts was sc reened us ing DPPH rad ica l scaveng ing m e thods.The content of anthocyanins in the p urp le cowp eas was57.15m g/100g FW.Three kinds of anthocyanin riched in the extrac ts which exhib ited s trong antioxidant ac tivity we re identified,they we re de lp hinid in3-O-g lucos ide,cyanid in3-O-g lucos ide,p e la rgornid in3-O-g lucos ide.

p urp le cowp ea;anthocyanins;antioxidant ac tivity

TS255.1

A

1002-0306(2010)03-0155-04

随着人们生活水平的提高和保健意识的增强,天然产物正逐渐取代化工合成产物在人们生活中所占的地位,在这种社会趋势中,天然来源的食品着色剂越来越受到人们的关注[1]。在众多的天然色素中,花色苷 (Anthocyanin)因其独特的性质成为了广为研究的对象,因为花色苷的颜色范围很宽,从红到蓝,包括桔黄色、紫色等颜色[2];它在植物体中的分布也广,不仅存在于植物的花朵、果实中,在一些植物中,茎、叶、根以及一些贮藏器官也含有大量花色苷[3];更为重要的是花色苷有超强的抗氧化能力,对人类许多慢性和衰老方面的疾病如心脏病、癌症、帕金森症以及对衰老有很好的预防和 (或)治疗作用[4]。花色苷是植物来源的水溶性色素-花色素 (Anthocyanidin)的糖苷化合物,属于类黄酮类多酚化合物,到目前为止已经在 25科 73属植物中发现了 575种[5]。这些单体花色苷之间的区别在于与母核结构相连的羟基、甲氧基、糖基的位置、数目、性质以及与糖基连接的脂肪酸和 (或)芳香酸的数目、性质不同[6]。在高等植物中,含量最高的花色苷是矢车菊 3-葡萄糖苷[7],而花色苷含量最高的是浆果类植物,如葡萄皮、蓝莓等。筛选价格低廉、花色苷含量高的植物品种既是花色苷研究中的基础也是重要的工作。对于大多数国家和地区的人民来说,蔬菜在日常饮食中要比水果、保健品占得比重高,所以筛选、培育一些富含花色苷的蔬菜,让人们普遍享受到花色苷对人体健康的益处,其意义是重大的。紫皮豇豆 (V igna unguiculataL.)蔓生,豆科一年生草本植物,是豇豆的一个地方品种,因夹的颜色为紫色而得名。紫皮豇豆含蛋白质、脂肪、碳水化合物、膳食纤维,还含有多种人体必需的维生素及微量元素。我国医学很早就有紫豇豆种子入药,能健胃补气、滋养消食的记载。但是,迄今为止还没有对紫皮豇豆中的花色苷进行过系统研究。本文就紫皮豇豆花色苷的含量,种类及其粗提取液的稳定性和抗氧化性进行初步研究,旨在为紫皮豇豆及其花色苷的应用提供理论依据。

2009-03-30 ＊通讯联系人

高华杰(1982-),男,硕士,研究方向：药用植物学。