壳聚糖偶联Cy3复合探针制备条件优化及光谱特性分析

王义启，费学宁，谷迎春，孟庆洋

(天津城市建设学院 材料科学与工程系，天津 300384)

荧光染料是一种广泛使用的荧光标示剂(又称为荧光探针)，它提供了比传统的同位素检测更实用、更安全的DNA片段标记方法，具有检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射且可实现测序的实时、在线、计算机处理等优点.在DNA自动测序、抗体免疫分析、疾病诊断、抗癌药物分析等方面已得到广泛应用[1-4].菁染料Cy3作为生物荧光探针分子，具有可修饰性强、吸光系数高、吸收波长可调范围大等优点[5]，是性能优良的荧光标记染料，广泛用于抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测[6-7].

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物，是天然多糖中唯一的碱性多糖，它具有良好的生物相容性、生物可降解性及独特的跨细胞膜能力[8].壳聚糖链中的伯胺基团很容易和生物分子发生反应，如：蛋白质、DNA、酶、抗原抗体、生物素以及荧光分子异硫氰酸酯等.因此，壳聚糖逐渐成为生物医学工程领域研究较多的材料之一[9].

本文通过菁染料 Cy3探针对壳聚糖的偶联，分析了其不同条件下的偶联规律及Cy3-CTS探针的光谱特性.菁染料 Cy3偶联壳聚糖的荧光探针分子不仅具备壳聚糖生物相容性和生物可降解性等优点，而且具备荧光染料光谱范围广、摩尔消光系数高和较高的荧光量子产率等优点，还进一步改善了荧光探针分子的灵敏度[10].

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

主要试剂壳聚糖(相对分子质量 2000，3000，5000，济南海得贝海洋生物工程公司)，二异丙基乙胺(DIEA，吉尔生化生物有限公司)，1-羟基苯并三唑(HOBT，吉尔生化生物有限公司)，O-苯并三唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，吉尔生化生物有限公司)；其它试剂均为分析纯.Cary Eclipse荧光分析仪(VARINA)，紫外分光光度计(UV2550，日本岛津).

1.2 壳聚糖(CTS)偶联Cy3的制备

菁染料Cy3根据文献[11]制备.

将适量 Cy3完全溶在二甲基甲酰胺(DMF)中，加入缩合剂HBTU、HOBT和DIEA(1∶1∶2)溶解完全，向溶液中加入壳聚糖水溶液(0.5 g/10 mL)，一定温度下搅拌一段时间.反应结束后，加入乙醚萃取三次，水相再用乙酸乙酯洗涤后加入丙酮，析出大量固体.用索氏提取器萃取，干燥得到红色固体.

1.3 Cy3-CTS制备条件的优化

通过用紫外分光光度计扫描 Cy3和 Cy3-CTS的最大吸收波长发现：Cy3与 Cy3-CTS有相同的紫外特征峰，最大紫外吸收波长均为 548 nm，且峰形一致，如图1所示.由于Cy3偶联壳聚糖后紫外吸收波长不受影响，因此可以利用 Cy3的紫外吸收强度与浓度的线性关系，确定壳聚糖修饰后的染料中所含Cy3的相对量.

图1 CTS-Cy3和Cy3的紫外吸收光谱

1.3.1 Cy3标准曲线的绘制

分别称取 1，2，3，4，5 mg 染料 Cy3，放置于 1 L容量瓶中，用去离子水溶解配置不同浓度的标准溶液，用紫外分光光度计分别测定 548 nm处的吸光度.以染料浓度对吸光度做标准曲线，如图2所示.

图2 Cy3的标准曲线

1.3.2 Cy3与壳聚糖偶联比的计算

不同条件下，复合探针CTS-Cy3偶联Cy3数量的相对量不同.将一定浓度的 CTS-Cy3水溶液在紫外分光光度计上测定548 nm 处的吸光度，然后在标准曲线上找到相应的 Cy3浓度，按下式计算出 Cy3-CTS的偶联比

式中：M为Cy3的相对摩尔数；M0为CTS-Cy3的总摩尔数.

2 结果与讨论

菁染料Cy3上的羧基经过活化剂活化后很容易与壳聚糖分子链上的氨基缩合，生成稳定的酰胺键，从而使菁染料与壳聚糖偶联得到新的复合探针分子，如图3所示.

2.1 CTS-Cy3偶联比条件的优化

在制备 CTS-Cy3的过程中，反应时间、温度、原料CTS与Cy3的比例以及壳聚糖的相对分子质量都对 CTS-Cy3的偶联比有较大影响，因此通过改变上述制备条件来比较不同CTS-Cy3的偶联比.

2.1.1 时间对CTS-Cy3偶联比的影响

在不改变温度和原料比例的情况下，分别计算1，4，10，24，48 h等不同时间制备的复合探针 CTSCy3偶联比，CTS-Cy3偶联比随时间变化的曲线如图4所示.

图3 CTS-Cy3反应示意图

图4 Cy3-CTS的偶联比随时间的变化曲线

从图4可以看出：开始CTS与Cy3的反应速度很快，壳聚糖上的氨基很容易与活化的羧基 Cy3反应生成稳定的酰胺键；随时间增长，壳聚糖偶联 Cy3的数量随之增多，然而 20 h后壳聚糖偶联染料数增长缓慢.分析认为主要原因是随着壳聚糖偶联染料数量的增多，空间位阻增大，从而不利于其他酰胺反应，致使CTS-Cy3的偶联比不增.所以20 h为最佳反应时间.

2.1.2 温度对CTS-Cy3偶联比的影响

保持反应时间和原料比例不变，分别计算不同温度下制备的CTS-Cy3偶联比，绘制CTS-Cy3偶联比随温度的变化曲线如图5所示.

图5 Cy3-CTS的偶联比随温度的变化曲线

从图5可以看出：随温度的上升壳聚糖氨基活性增强，壳聚糖偶联 Cy3的数量随之增多；在 70 ℃后，CTS-Cy3的偶联比有所下降.原因可能由于温度过高，导致壳聚糖大分子活性降低，降低自由基引发能力，不利于酰胺反应的发生，而高温下酰胺键的不稳定性可能导致 CTS-Cy3偶联比的下降.因此从图 5中可以直观地看出70 ℃为反应最佳温度.

2.1.3 壳聚糖与 Cy3投料比例对 CTS-Cy3偶联比的影响

保持反应时间和反应温度不变，分别计算不同比例原料投量下制备的CTS-Cy3偶联比，绘制 CTSCy3偶联比随原料投料比例的变化曲线，如图6所示.

图6 Cy3-CTS的偶联比随原料比例的变化曲线

从图6可以看出：随着 Cy3浓度的增大，溶液体系扩散加快，酰胺反应点增多，所以壳聚糖偶联染料的数量随之增多，偶联比增大；在 1∶2之后，CTSCy3的偶联比增长缓慢.这是因为随着染料浓度的增加，体系的黏度增大，单体难以扩散到偶联活性中心，导致染料在壳聚糖溶液的溶解度降低，直接沉降下来，致使CTS-Cy3的偶联比不增[12].所以1∶2为最佳投料比例.

2.1.4 壳聚糖的相对分子质量对CTS-Cy3偶联比的影响

保持温度、时间和原料投量比例不变，增加 CTS的链长，相对分子质量 3000的壳聚糖偶联比为13.74%与相对分子质量 2000的相比增加两个百分点，相对分子质量5000的壳聚糖偶联比为29.6%.随壳聚糖碳链的增长，空间位阻小，产生的自由基增多，引发染料偶联壳聚糖共聚物增多，所以偶联比随相对分子质量的增大而增大；但由于偶联比增大，氢键作用增大，致使产物的水溶性不好，不利于以后产物作为探针对细胞的标记.因此认为相对分子质量 3000的壳聚糖为制备复合探针原料的最佳选择.

综上所述，CTS-Cy3制备的最佳条件为：70 ℃下，相对分子质量为 3000的壳聚糖与 Cy3比例为1∶2，反应20 h所得的复合探针分子CTS-Cy3.

2.2 壳聚糖偶联Cy3的光谱特性

配置一定浓度Cy3的标准溶液和等当量Cy3摩尔浓度相同的 CTS-Cy3标准溶液储存备用.用荧光分光光度计测定对比 Cy3和 Cy3-CTS的荧光发射光谱，荧光扫描激发波长为 548 nm，激发狭缝 5 nm，发射狭缝5 nm，发射光谱如图7所示，Cy3-CTS的荧光光谱数据如表1所示.

图7 Cy3和CTS-Cy3的荧光光谱

表1 Cy3和Cy3-CTS的荧光光谱数据

从图 7及表 1可以看出：Cy3偶联壳聚糖后，荧光最大吸收波长不变，而荧光强度明显增强，优化后CTS-Cy3的 stocks位移无明显变化，而量子产率增加1.5倍，说明CTS-Cy3相对Cy3有荧光加合增效.

3 结 论

将菁染料 Cy3偶联壳聚糖得到复合探针，并研究其制备过程中不同条件下的偶联规律及光谱特性.研究表明：在 70 ℃以下，相对分子质量为 3000的壳聚糖与 Cy3的比例为1∶2、反应20 h得到的复合探针最佳.通过紫外及荧光光谱发现，壳聚糖复合探针与菁染料具有相同的最大紫外吸收波长，且有明显的荧光加合增效.CTS-Cy3复合探针具备菁染料光谱范围广、摩尔消光系数高和较高的荧光量子产率等优点，为用于进一步改善荧光探针分子的灵敏度方面提供了工作基础.

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