淀粉的支链精细结构与消化性能

缪 铭，张 涛，沐万孟，江 波，金征宇

(江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

淀粉的支链精细结构与消化性能

缪 铭，张 涛，沐万孟，江 波，金征宇

(江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

采用高效液相排阻色谱技术探索不同淀粉中支链淀粉精细结构与其慢消化性能的关系。结果表明：支链淀粉结构中的链长分布FrⅠ(DP＞30)、FrⅡ(13＜DP＜30)均与慢消化淀粉(SDS)呈极显著正相关(r＝0.909，P＜0.05；r＝0.847，P＜0.05)；FrⅢ(DP＜13)与SDS呈极显著负相关(r=－0.869，P＜0.05)。支链淀粉的分支链长分布与淀粉低血糖特性关系密切，可采用基因工程调控淀粉链合成从而开发高营养品质的新淀粉品种。

支链淀粉；精细结构；慢消化性；链长；低血糖生成指数

淀粉是高等绿色植物中常见的贮藏性多糖，其结构主要由直链状和支叉状分子组成的，前者是脱水葡萄糖单位间经α-1,4糖苷键连接；后者支叉位置是α-1,6糖苷键连接，其余为α-1,4糖苷键连接，不同侧链可分为A链(外链)、B链(内链)和C链(主链)，这些侧链形成双螺旋簇状结构并堆积成结晶结构[1-3]。同时，淀粉也是人类和大多数动物的主要能量来源，而淀粉消化的难易程度影响餐后血糖应答，从而导致许多与饮食相关慢性疾病(如糖尿病、心血管疾病、糖原累积症等代谢综合症)的出现[4-5]。依据体外模拟淀粉的消化速率，Englyst等[6]从营养学角度将其划分为易消化淀粉(RDS)、慢消化淀粉(SDS)与抗性淀粉(RS)3类。其中，SDS与RS属于低血糖食品，具有缓慢吸收、持续释放能量，维持血糖稳态，预防和治疗各种疾病的特性[5]。

Zhang等[7-8]在研究报告提到淀粉的消化性能由结晶区域的分布和完整性决定，与淀粉分子形状、大小，表面细孔以及淀粉结晶度没有直接关联。淀粉类食品消化速率的差异与其直链淀粉含量有关，但Panlasigui等[9]报道直链淀粉含量不能很好预测淀粉的消化速率，淀粉理化性质(糊化)影响淀粉的消化性能和血糖应答；而淀粉糊化特性与颗粒结构有关，其中支链淀粉的长链部分[聚合度(DP)＞100]与糊黏度崩解值成负相关[10]。Guraya等[11]采用蜡质淀粉经普鲁兰酶脱支改性可制得SDS，Ao等[12]通过β-淀粉酶和麦芽糖α-淀粉酶部分缩短支链淀粉侧链(A链与B链)和直链淀粉的长度来增加淀粉的分支密度和结晶结构降低淀粉的消化速率，这些表明淀粉的精细结构对淀粉的消化影响很大。本实验对淀粉的支链精细结构与消化性能进行分析探讨，旨在为利用基因修饰技术培育高含量低血糖淀粉品种提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通玉米淀粉、糯米淀粉 无锡泰花淀粉有限公司；蜡质玉米淀粉 长春大成玉米开发有限公司；大米淀粉 江苏宝宝集团公司；小麦淀粉 上海欣发调味食品厂；马铃薯淀粉 云南润凯淀粉有限公司。

异淀粉酶 爱尔兰Megazyme公司；猪胰α-淀粉酶 美国Sigma公司；GL-L NEW糖化酶 无锡Genencor Bio-Product公司；葡萄糖试剂盒(GOD-PAD) 爱尔兰Megazyme公司；普鲁兰标样 瑞典Pharmacia公司；醋酸钠、无水乙醇、柠檬酸、氢氧化钠等 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Ultrahydrogel 120、250、500和1000高效液相排阻色谱柱 美国Waters公司；LC-10AT输送泵、RID-10A折光检测器 日本Shimadzu公司；SHA-2冷冻水浴恒温振荡器 江苏亿通电子有限公司；21E可见分光光度计 上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉的预处理

支链淀粉的分离纯化参照Takeda等[13]提取的方法。称取1g淀粉，加入少量无水乙醇分散并湿润样品，再加入15mL 0.5mol/L的氢氧化钠，在沸水浴中搅拌10min，冷却后离心去掉分散物。用2mol/L的盐酸中和离心液，加入10mL体积比为1:1的丁醇-异戊醇，在沸水浴中加热搅拌10min后，冷却至室温，移入2～4℃冰箱中静置24h，取出后高速离心，取上清离心液并加入10mL体积比为1:1的丁醇-异戊醇，沸水浴中加热搅拌10min，冷却至室温，移入冰箱内(2～4℃)静置48h，于8000r/min高速离心10min，离心上清液中加2倍体积无水乙醇，静置，离心，沉淀于50℃烘干，即得支链淀粉。

称取10mg淀粉加入0.9mL蒸馏水，充分振荡，95℃水浴加热15min，然后冷却至室温，加入2.5mL 0.1mol/L的醋酸钠缓冲液(pH4.0)后，加入5μL异淀粉酶(1000U/mL)，于40℃水浴保温振荡24h。脱支处理后的样品离心取上清液，经0.45μm的纤维素酯微孔膜过滤后进行HPSECRI分析。

1.3.2 色谱分析条件

选用Ultrahydrogel 120、250、500和1000水相高效液相排阻色谱柱串联分析，流动相采用0.1mol/L NaNO3溶液，流速为0.6mL/min，流动相的折光指数取1.334，淀粉样品的比折光指数增量dn/dc为0.160。使用柱温箱将柱温保持在40℃。

采用5种不同相对分子质量的普鲁兰标样(MW41100、MW21400、MW13380、MW7100、MW2500)来校正柱子。脱支淀粉样品的DP依据普鲁兰标样分子质量MW计算，公式为DP＝MW/162。所得典型双峰曲线通过峰值积分软件分析确定FrⅠ(长链，DP＞30)、FrⅡ(中等长链和短链，13＜DP＜30)、FrⅢ(最短链，DP＜13)等不同链长部分比例。

1.3.3 淀粉的消化性能测定

淀粉不同的营养片断分析是根据Englyst等[6]提出的体外模拟酶水解法进行了适当改进。称取200mg淀粉样品置于测试管中，添加15mL pH5.2的0.2mol/L醋酸钠缓冲液，混匀后沸水浴蒸煮处理20min，冷却至室温后加入10mL的猪胰α-淀粉酶(290U/mL)和糖化酶(15U/mL)，置于37℃恒温水浴中振荡(转速为150r/min)并准确计时。水解20min或120min后取出0.5mL水解液加4mL无水乙醇灭酶，然后离心处理后的上清液用葡萄糖氧化酶法在510nm波长处比色测定产生的葡萄糖含量。具体计算公式如下。

式中：m20为淀粉酶水解20min后产生的葡萄糖质量/mg；mFG为酶水解处理前淀粉中游离葡萄糖质量/mg；m120为淀粉酶水解120min后产生的葡萄糖质量/mg；mTS为样品中总淀粉质量/mg。

1.3.4 统计学相关分析

淀粉消化性能与支链淀粉中不同链长片断双变量的相关性采用SPSS12.0分析软件中的Pearson简单相关系数来评价。

2 结果与分析

2.1 淀粉的支链精细结构分析

图1 异淀粉酶脱支处理淀粉的色谱图Fig.1 Chromatogram of isolated and debranched amylopectin from different starches

不同淀粉品种的支链淀粉经异淀粉酶脱支，然后过凝胶色谱柱分析，得支链淀粉分支链长分布，图1是经脱支处理后不同支链淀粉分支链的色谱图，FrⅠ、FrⅡ和FrⅢ是根据链长或聚合度大小定义的(由大到小)，各峰所占面积的比率如表1所示。除小麦淀粉的分支链分布为三峰曲线外，其他如普通玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、糯米淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉均表现双峰曲线，这与Hizukuri报道的结论基本一致[2-3]。

表1 淀粉脱支色谱图中不同链长部分的面积Table 1 Area of FrI, FrII and FrIII in chromatograms of debranched amylopectin from different starches %

不同品种支链淀粉的长链与短链分配的比率存在明显的差异，在供试谷物淀粉中，蜡质玉米淀粉的支链含较多长链(FrⅠ+FrⅡ)，大米淀粉含有较多短链(FrⅢ)。依据侧链各自的长度和跨越的簇的数量，在支链淀粉分子内典型A链的聚合度为小于13(最短链)，B1链的聚合度为13～30(中等长链和短链)，B2、B3等链的聚合度大于30(长链)[2-3]。因此，可推断出蜡质玉米支链淀粉中含有高比例的B1链，其次是B2、B3等链，A链最少。不同淀粉的支链分布的差异原因可能与供试的品种不同有关，如合成淀粉的酶、环境因素等。

2.2 淀粉的消化性能分析

根据消化时间不同，淀粉可划分RDS、SDS与RS 3种片断，其中，RDS食用后产生高血糖应答，易产生胰岛素抗性，SDS持续缓慢释放葡萄糖，具有低血糖食品的特性，而RS只在大肠中发酵产生短链脂肪酸，有利于肠道健康[4-5]。因此，SDS与RS均可以改善淀粉的营养品质。

图2 淀粉中不同营养片断的生物可利用性分类Fig.2 Bioavailability classification of nutritional starch fractions

由图2可以看出，淀粉在蒸煮处理后主要含RDS，而SDS与RS的量很少。根据Fernandes等[14]与Zhang等[7-8]的研究报道，A型结构的天然谷物淀粉是理想的SDS材料(约50%)，B型结构的天然马铃薯淀粉属于高RS(76%)，这说明淀粉的营养片断与其结晶结构有关。蒸煮处理使不同来源淀粉中SDS与RS差异基本消失并转化成RDS而导致其比例增大，这可能使加热过程完全破坏天然淀粉粒的半结晶结构。不同品种的玉米或米淀粉含有SDS与RS的比例不同，这表明可以采用基因突变方法可以来改变淀粉的营养品质，而且最有效的方法是降低RDS来提高SDS或RS。

2.3 相关性分析

表2 淀粉链长片断与消化性能的相关性Table 2 Correlation between amylopectin chain fractions and digestibility of different starches

由表2相关性分析可以看出，支链淀粉的分支链链长分布与淀粉的SDS片断密切相关。其中FrⅠ、FrⅡ均与SDS呈极显著正相关，相关系数分别为0.909和0.847；FrⅢ与SDS呈极显著负相关，相关系数为－0.869。这说明支链淀粉含的长链越多，淀粉中SDS片断的含量越高。分析其原因可能是分支淀粉长链的双螺旋结构与蛋白、脂质相互作用形成复合物，抑制淀粉的膨胀，同时，支链淀粉含有的长链可使糊化过程中支链淀粉结构不易破裂，而维持胶稠化的淀粉颗粒结构，从而导致SDS含量较高[5,10]。因此支链淀粉含长链(FrⅠ与FrⅡ)比例越高，淀粉颗粒不易充分糊化，保持淀粉的慢消化性能。

支链淀粉精细结构通过可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)与淀粉脱支酶(DEB)来调节合成，支链淀粉侧链A链只受SBE单独调控，而B链则受SBE 和SSS双重控制，而淀粉支链簇状结构则由DBE 和SBE两者活性相互协调形成[15-16]。支链淀粉分布模式与链长可通过抑制或表达这3种酶活性来实现工程化。因此，采用转基因技术可在不影响淀粉产量的基础上调控淀粉的构成，从而可以改良淀粉营养品质(低血糖应答)。

3 结 论

以不同来源的淀粉为原料，通过凝胶色谱技术测定淀粉支链精细结构中分支链的链长分布，同时分析其与淀粉消化性能之间的关系。支链淀粉中含长链(FrⅠ与FrⅡ)比例越高，糊化后淀粉中SDS片断越多。因此，本实验可以为开发低血糖淀粉提供一种新的方法，即采用基因改性法来生产新的功能性淀粉。

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Relationship between Fine Structure of Amylopectin and Digestibility from Cereal Starch

MIAO Ming，ZHANG Tao，MU Wan-meng，JIANG Bo，JIN Zheng-yu
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The correlation between starch digestibility and fine structure of amylopectin was investigated in this study. Slowly digestible starch (SDS) fraction was positively correlated (r = 0.909, P ＜ 0.05; r = 0.847, P ＜ 0.05) with FrI (DP ＞ 30) and FrII(13 ＜ DP ＜ 30), respectively, and negatively correlated (r = － 0.869, P ＜ 0.05) with FrIII (DP ＜ 13). Thus, the chain length distribution of debranched amylopectin exhibited a relationship with low glycemic index. These investigations revealed a molecular basis of fine structural variability in amylopectin for starch digestion property and could provide a strategy to develop raw starch materials with high nutritional value.

amylopectin； fine structure；digestibility；chain length；low glycemic index

TS201.23

A

1002-6630(2010)09-0012-04

2009-09-28

国家自然科学基金项目(20976073)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD05A07-A-02)；江苏省自然基金创新学者攀登项目(BK2008003)；江南大学食品科学与技术国家重点实验室目标导向资助项目(SKLF-MB-200804)；江南大学自主科研计划资助项目(JUSRP10930)

缪铭(1980—)，男，副教授，博士，研究方向为功能性碳水化合物。E-mail：miaoming@jiangnan.edu.cn