双歧杆菌RH菌株不同处理物修复肠道菌群平衡失调的研究

尚 楠，刘丽莎，旭日花*，武瑞赟

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

双歧杆菌RH菌株不同处理物修复肠道菌群平衡失调的研究

尚 楠，刘丽莎，旭日花*，武瑞赟

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

为探讨双歧杆菌RH菌株对肠道菌群平衡失调的修复功能，本研究通过动物实验，考察双歧杆菌活菌(LB)、菌体破碎物(CE)及发酵上清液(FS)3种处理物灌胃由抗生素造成的菌群失调模型小鼠后对其肠道内双歧杆菌、乳杆菌、产气荚膜梭菌、肠球菌、肠杆菌和拟杆菌6大类主要菌群的影响。结果显示：3种处理物均可使小鼠肠道内双歧杆菌和乳杆菌数量极显著增加(P＜0.01)，产气荚膜梭菌和肠球菌数量显著降低(P＜0.05和P＜0.01)，并能使肠杆菌和拟杆菌数量恢复至正常水平，说明该双歧杆菌LB、CE和FS均可起到修复、调节小鼠肠道微生态平衡的作用。

双歧杆菌；肠道菌群；菌群失调；修复

人体肠道内存在数量庞大的肠道菌群，大约有100万亿个细菌，包括30个属的500多种菌，其菌体总体积相当于一个人的肝脏[1]。微生态研究表明，肠道微生物是人类健康和疾病的重要决定因素，这些微生物既包括有益菌，也包括有害菌。

乳杆菌和双歧杆菌是肠道内主要益生菌，与其他厌氧菌一起形成肠道的生物屏障，对致病菌及条件致病菌的定植入侵构成一种定植抗力，保持肠道正常的微生态平衡，并且参与营养物质代谢，构建免疫防御系统，对维持宿主健康起着重要的作用[2]。因此，保持肠道内有益菌群的数量是宿主保持健康的关键因素。然而，气候变化、摄入污染食物、精神状况、手术、外伤及患过敏性疾病等外来因素的影响，以及人体老化、应用抗生素、免疫抑制剂、抗癌剂、激素、辐射均能导致人体抵抗力下降，使致病菌和条件致病菌大量繁殖，双歧杆菌、乳杆菌等有益菌减少，造成肠道内菌群发生紊乱，引起腹泻、消化不良、维生素B族缺乏症、低蛋白血症、便秘等临床疾病。

随着微生态学的发展，已有许多针对菌群失调的微生态学疗法，其中以应用双歧杆菌活菌制剂为主[3]。研究证明，摄入外源的双歧杆菌等微生态制剂可以起到修复肠道菌群失调，促进内源性有益菌增殖的作用[4-5]。本实验以双歧杆菌RH菌株的活菌、发酵上清液、菌体破碎物为材料，研究双歧杆菌不同处理物对菌群失调小鼠肠道菌群平衡的影响和修复，旨在为进一步探讨双歧杆菌的生理功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

双歧杆菌RH分离自广西巴马长寿老人肠道，由本实验室分离并保存。该菌株经生理生化实验和1 6 S rDNA序列分析鉴定为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)。

1.1.2 动物

近交系BALB/C小鼠70只，体质量18～22g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.1.3 培养基及培养条件

双歧杆菌：BBL琼脂培养基，(36±1)℃厌氧培养48～72h；乳杆菌：MRS培养基(pH 5.4)，(36±1)℃培养48h；产气荚膜梭菌：TSC琼脂培养基，(36±1)℃厌氧培养24h；拟杆菌：改良GAM琼脂培养基，(36±1)℃厌氧培养48～72h；肠球菌：叠氮化钠-结晶紫-七叶苷培养基，(36±1)℃培养48h；肠杆菌：VRPD培养基，(36±1)℃培养24h。盐酸林可霉素及6种培养基配制用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

亨盖特厌氧装置；JY92-II超声波细胞破碎仪 宁波新芝科技研究所；SCL-1300型垂直流洁净工作台 北京赛伯乐实验仪器有限公司；YXQ-LS-75SII全自动高压灭菌锅 上海博迅实验设备有限公司；DNP-9162型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备公司；HH.S21-6恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂； TGL-20M高速冷冻离心机 湖南长沙平凡仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受试物制备

将双歧杆菌RH按1%(菌浓度107CFU/mL)接种量接种于500mL改良MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h至菌液浓度为1×109～3×109CFU/mL，将菌液4000r/min离心10min，分离得到发酵上清液(FS)。菌体用去离子水迅速洗涤两次，再用相同体积的去离子水重悬双歧杆菌沉淀，所得菌悬液分为两组，一组作为活细胞组(live bacteria，LB)，另一组菌悬液经65℃处理40min后，用超声波粉碎仪在2kHz条件下处理，每处理2min、间隔lmin，超声粉碎40min，显微镜下检查没有完整菌体后以7800r/min离心10min，收集上清液即为菌体破碎物(cell-free extract，CE)。

1.3.2 抗生素菌群失调模型的建立

随机选择14只小鼠(雌雄各半)作为阴性对照组，灌胃生理盐水；其余为抗生素模型组，小鼠腹腔注射盐酸林可霉素，连续3d，灌胃剂量50mg/(kg bw·d)。3d后检测肠道主要菌群，与阴性对照组比较，建立菌群失调模型，然后进行后续实验。

1.3.3 实验动物分组及给药

将上述菌群失调模型小鼠随机分成4组，即LB组、FS组、CE组和自然恢复组，每组14只，雌雄各半。双歧杆菌RH的3种受试物采取灌胃方式给药，每天1次，每次0.2mL，连续14d，自然恢复组和上述阴性对照组继续以生理盐水灌胃，第15天进行6大类肠道主要菌群的测定。

1.3.4 小鼠肠道菌群的检测

最后1次给予双歧杆菌不同受试物24h后，无菌采取小鼠粪便0.1g于灭菌试管内，10倍稀释至10-8，选择10-6～10-8四个稀释度，分别倾注于1.1.3节6种选择性培养基中，经培养后，对特征性菌落进行Gram染色镜检、接触酶实验、糖醇发酵实验后计算出每克湿粪便中的菌数，然后取对数进行统计分析。

按中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》中的动物实验调节肠道菌群功能的评价标准，根据给予受试物后小鼠肠道菌群值的变化进行评价[6]。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 抗生素菌群失调小鼠模型的建立

抗生素处理正常小鼠后，抗生素模型组和正常阴性对照组小鼠的6大类肠道菌群的比较结果如表1所示。

从表1可知，模型组与阴性对照组相比，双歧杆菌和乳杆菌的数量显著降低(P＜0.01)，产气荚膜梭菌和肠球菌极显著增加(P＜0.01)，说明给小鼠连续3d腹腔注射盐酸林克霉素能破坏肠道正常的菌群平衡，表明该抗生素菌群失调模型建立成功。

2.2 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道双歧杆菌的影响

表1 抗生素模型组与阴性对照组小鼠的肠道菌群比较Table 1 Comparison of intestinal flora in antibiotic model group and normal control group¡¡ lg(CFU/g)

图1 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道双歧杆菌的影响Fig.1 Effect of LB, CE and FS on intestinal Bifidobacteria in mice with imbalanced intestinal flora

从图1可知，3种受试物灌胃小鼠后，与自然恢复组相比，均可极显著提高双歧杆菌的数量(P＜0.01)。FS组和LB组的效果最佳，两者之间促进双歧杆菌生长的效果无显著性差异；但LB组和FS组与CE组间有显著性差异(P＜0.05)。另外，3种受试物灌胃组与阴性对照组相比均显著促进小鼠肠道内双歧杆菌的增殖(P＜

0.01)。说明抗生素破坏肠道菌群平衡后，灌胃双歧杆菌的不同处理物均可显著提高双歧杆菌的增殖，使其恢复至高于正常小鼠的肠道双歧杆菌数量的水平。

2.3 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道乳杆菌的影响

图2 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道乳杆菌的影响Fig.2 Effect of LB, CE and FS on intestinal Lactobacillus in mice with imbalanced intestinal flora

从图2可知，3种受试物灌胃小鼠后，与自然恢复组相比，均可极显著提高乳杆菌的数量(P＜0.01)。3种受试物对乳杆菌的增殖效果彼此之间无显著性差异。另外，3种处理组的乳杆菌数量与阴性对照组相比，均无显著性差异(P＞0.05)。表明LB、CE和FS均可调整肠道菌群失调小鼠的乳杆菌数量，使其恢复至正常水平。

2.4 双歧杆菌RH不同处理物对菌群失调小鼠肠道产气荚膜梭菌的影响

图3 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道产气荚膜梭菌的影响Fig.3 Effect of LB, CE and FS on intestinal Clostridium perfringens in mice with imbalanced intestinal flora

从图3可知，3种受试物灌胃小鼠后，均可降低肠道产气荚膜梭菌的数量。与自然恢复组相比，除CE组无显著性差异外，LB组和FS组均有显著性差异(P＜0.05)。与阴性对照相比，LB组和FS组均有显著性差异(P＜0.05)，而CE组的产气荚膜梭菌数量显著高于阴性对照组(P＜0.05)。说明除CE外，LB和FS均可调节肠道菌群失调小鼠的肠道产气荚膜梭菌的数量，使其降低至低于正常水平。

2.5 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道拟杆菌的影响

图4 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道拟杆菌的影响Fig.4 Effect of LB, CE and FS on intestinal Bacteroide in mice with imbalanced intestinal flora

从图4可知，3种受试物灌胃小鼠后，与自然恢复组相比，均可极显著提高肠道拟杆菌的数量(P＜0.01)。其中，FS组与阴性对照组相比无显著性差异。表明双歧杆菌RH的LB、CE和FS均可使肠道菌群失调小鼠的拟杆菌数量恢复至正常水平。

2.6 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道肠球菌的影响

图5 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道肠球菌的影响Fig.5 Effect of LB, CE and FS on intestinal Enterococcus in mice with imbalanced intestinal flora

从图5可知，双歧杆菌RH的3种受试物对小鼠灌胃后与自然恢复组相比，均可极显著降低肠道肠球菌的数量(P＜0.01)，但彼此之间无差异显著性。与阴性对照组相比，3组均无显著性差异。表明肠道菌群失调小鼠的肠道肠球菌可以由双歧杆菌RH的LB、CE和FS调节至正常水平。

2.7 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道肠杆菌的影响

图6 双歧杆菌RH不同处理物对肠道菌群失调小鼠肠道肠杆菌的影响Fig.6 Effect of LB, CE and FS on intestinal Enterobacteriaceae in mice with imbalanced intestinal flora

从图6可知，3种受试物灌胃小鼠后与自然恢复组相比，均可极显著提高肠道肠杆菌的数量(P＜0.01)，但3种处理组之间均无显著性差异。3种处理组的肠杆菌数量略高于阴性对照组，但无显著性差异。表明肠道菌群失调小鼠的肠杆菌也可被双歧杆菌RH的LB、CE和FS调节至正常水平。

实验同时还发现，自然恢复组与起初建立的抗生素模型组之间的双歧杆菌和乳杆菌数量存在显著性差异(P＜0.05)，说明抗生素致小鼠肠道菌群失调后，机体自身有一定的自我修复功能，但与双歧杆菌3种处理组相比存在极显著差异(P＜0.01)。

综合双歧杆菌RH 三种不同处理物灌胃肠道菌群失调小鼠后上述6大类微生物菌群的变化情况可以明显看出，3种受试物均可极显著提高小鼠肠道双歧杆菌、乳杆菌的数量(P＜0.01)，极显著提高肠道拟杆菌、肠杆菌数量(P＜0.01)，极显著降低肠道肠球菌的数量(P＜0.01)；活菌和发酵上清液能显著降低产气荚膜梭菌数量(P＜0.05)。根据《保健食品检验与评价技术规范》中的评价标准，该双歧杆菌RH的LB、CE和FS具有明显的修复肠道菌群平衡的作用。

3 讨 论

抗生素为人类征服感染发挥了巨大的作用，然而，临床上存在抗生素滥用现象。近年来，抗生素广泛使用以致肠道菌群失调甚至肠道菌群产生耐药性的现象日益严重。抗生素在杀灭病原微生物的同时也抑制了肠道正常菌群中的有益菌，破坏机体内相对稳定的生态屏障，导致肠道菌群的构成、功能发生改变，影响机体的免疫力[7]。另外，由于抗生素的选择作用，一些细菌通过突变产生了对抗生素的耐药性，或者使原来的耐药性细菌大量增殖，造成肠道菌群失调及抗生素的相关肠炎[1]。本实验结果表明，大剂量使用抗生素破坏小鼠肠道菌群平衡后，补充双歧杆菌RH的3种不同处理物，无论是活菌体、菌体破碎物还是发酵上清液均可起到促进体内双歧杆菌、乳杆菌大量增殖，抑制产气荚膜梭菌的生长，同时使肠球菌数量降低，肠杆菌的数量升高，达到肠道菌群平衡，起到修复菌群失调的作用。由此可见，在使用抗生素治疗疾病时，可食用双歧杆菌及其培养物，防止抗生素引起的菌群失调，避免抗生素造成的不良后果，从而起到预防和治疗疾病的作用。

据报道，饲喂含双歧杆菌的微生态制剂可增加健康动物和人肠道中双歧杆菌的数量，降低肠杆菌的数量，从而改善肠道菌群的组成和比例[8-9]。但外源双歧杆菌对肠道菌群的调整机制还不清楚，可能是外源双歧杆菌在肠道内生长定植的结果[10-11]，也可能是外源摄入的双歧杆菌造成了肠道内双歧杆菌数量增加的结果[12]。也有一些研究者推测可能是双歧杆菌代谢过程中大量产生乙酸和乳酸，降低肠道的pH值及氧化还原电位值(Eh值)，改善局部微环境，增进肠道菌群失调的恢复[13]。本实验证明双歧杆菌RH的活菌、菌体破碎物和发酵上清液均能增加小鼠肠道双歧杆菌、乳杆菌的数量而降低肠球菌的数量，说明双歧杆菌对机体肠道菌群的调整可能是多种作用的结果。确切的调整肠道菌群平衡的机制还有待更深入研究。

[1] GUAMER F, MALAGELADA J R. Gut flora in health and disease[J].Lancet, 2003, 361 (9356): 512-519.

[2] GUAMER F. Role of intestinal flora in health and disease[J]. Nutr Hosp,2007, 22(Suppl 2): 14-19.

[3] 伦永志, 黄敏, 袁杰利, 等. 灭活双歧杆菌调整小鼠抗生素相关性菌群失调[J]. 中国微生态学杂志, 2002, 14(1): 8-9.

[4] 郭兴华. 益生菌: 基础与应用[M]. 北京: 北京科学技术出版社, 2002.

[5] 余倩, 周蓉, 裴晓方, 等. 双歧杆菌活菌液对肠道菌群调节效果的研究[J]. 现代预防医学, 2008, 35(20): 4038-4040.

[6] 中华人民共和国卫生部．保健食品检验与评价技术规范[S]. 北京:国家食品药品监督管理局, 2003.

[7] 石梅. 思密达对实验性小鼠肠道菌群及免疫功能影响的研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2007.

[8] ESTRADA A, DREW M D, VAN KESSEL A. Effect of the dietary supplementation of fructooligosaccharides and Bifidobacterium longum to early-weaned pigs on performance and fecal bacterial populations[J].Canadian Journal of Animal Science, 2001, 81(1): 141-148.

[9] LEE S M, LEE W K. Effects of lactic acid bacteria on intestinal microbial enzyme activity and composition in rats treated with azoxymethane[J]. Journal of Microbiology, 2001, 39(3): 154-161.

[10] LIN D C. Probiotics as functional foods[J]. Nutrition in Clinical Practice,2003, 18(6): 497-506.

[11] 杨涛毅, 彭珉娟, 陈桂华, 等. 调节小鼠肠道菌群和预防肠道菌群失调探讨[J]. 四川医学, 2008, 29(7): 815-817.

[12] 孟祥晨, 霍贵成. 双歧杆菌对正常小白鼠免疫调节及肠道菌群的影响[J]. 东北农业大学学报, 2004, 35(4): 458-464.

[13] ARUNACHALAM K D. Role of bifidobacteria in nutrition, medicine and technology[J]. Nutrition Research, 1999, 19(10): 1559-1597.

Restoration Capability of Bifidobacteria with Different Treatments on Imbalanced Flora in Intestine

SHANG Nan，LIU Li-sha，XU Ri-hua*，WU Rui-yun
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In order to explore the restoration capability of Bifidobacteria on imbalanced flora in intestine, live bacteria (LB),cell-free extract (CE) and fermentation supernatant (FS) of Bifidobacteria were used to treat the vancomycin-induced mice model with imbalanced flora by gastric gavage. The effects of three different treatments of Bifidobacteria on major species of intestinal flora were evaluated. Results showed that three different treatments could significantly increase the proliferation of Bifidobacteria and Lactobacillia (P ＜ 0.01) and decrease the amounts of Clostridium perfringens and Enterococcus (P ＜ 0.05 and P ＜0.01).Bacteroide and Enterobacteriaceae were increased to the normal level. Therefore, LB, CE and FS of Bifidobacterium RH could restore and modulate the intestinal microecological balance of mice.

Bifidobacterium；ntestinal flora；imbalance；restoration

Q936

A

1002-6630(2010)23-0300-05

2010-11-02

国家大学生创新性实验计划项目(091001924)；国家“863”计划项目(2008AA10Z324)

尚楠(1990—)，女，本科生，研究方向为益生菌与益生元的开发与利用。E-mail：echoppig@126.com

旭日花(1981—)，女，讲师，博士，研究方向为食品微生物与发酵工程。E-mail：xurihua81@126.com