新疆天山北部地区加工番茄上ToMV和CMV的动态分析

赵祥树,向本春,刘升学,都业娟

(石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室,石河子832003)

新疆天山北部地区加工番茄上ToMV和CMV的动态分析

赵祥树,向本春,刘升学,都业娟

(石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室,石河子832003)

为研究加工番茄上 ToMV和CMV消长动态,采用RT-PCR方法对新疆天山北部6个地区采集的加工番茄样品进行了分子检测。结果表明:不同地区的138份加工番茄样品中,石河子、奎屯、乌苏的样品在存在CMV和ToMV,并以CMV为主,ToMV次之;从石河子蔬菜研究所,按不同品种不同时间采集的加工番茄660份样品中,CMV的检出率为21.5%,ToMV的检出率为12.1%,2种病毒的复合检出率为8.9%,病毒的检出率明显低于往年;CMV和 ToMV分别在6月25和7月11日左右开始发生,CMV比 ToMV早发生10-15 d。2种病毒的发生高峰期都在8月中下旬,复合侵染发病期在7月下旬;品种间2种病毒的消长动态没有明显的差异。

检测;RT-PCR;黄瓜花叶病毒;番茄花叶病毒;消长动态

Abstract:The population dynamics of the processing tomato samples collected from six regions in the north of Tianshan mountains were detected by RT-PCR.Among 138 processing tomato samples collected from different regions,CMV and ToMV were detected in Shihezi,Kuitun and Wusu.Among 660 processing tomato samples collected from different varieties and different periods in the Shihezi Vegetable Institute,the incidences of CMV and ToMV were 21.5%and 12.1%respectively,and the mixed infection was 8.9%.The beginning occurrence of CMV and ToMV appears in June 25 and July 11 respectively.The occurrence of CMV is 10-15 days earlier than that of ToMV.The peak period of ToMV and CMV were all in middle and late August,and the mixed infection was at the end of July.There was no obvious difference for the dynamics of ToMV and CMV among varieties.

Key words:detection;RT-PCR;tomato mosaic virus;cucumber mosaic virus;population dynamics

在我国引起番茄病毒病害的病原主要有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯 X病毒(Potato virus X,PVX)和马铃薯 Y病毒(Potato virus Y,PV Y)等[1-2],而危害新疆加工番茄的主要病原是 TMV、CMV和番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)等[3-4]。

T oMV寄主范围很广,能侵染茄科、十字花科等许多种植物,其中茄科的番茄是其最主要的寄主。受侵染作物产生花叶、植株矮化等症状,有时甚至植株死亡,严重影响了作物(尤其是番茄)的产量和品质,T oMV发生严重的作物能减产20%以上[5],T oMV在茄科作物中发生较普遍,其中侵染番茄的烟草花叶病毒属病毒中 T oMV占绝大多数[6]。CMV最早由Doolittle[7]和Jagger[8]于1916年报道,现已成为世界范围内危害蔬菜最严重的5种病毒之一,常使许多重要经济和观赏植物表现出蕨叶、丛枝、坏死等症状,是禾谷类、蔬菜、果树等植物的重要病原。

近年来,新疆加工番茄上检测出 ToMV[4],并且常与CMV复合侵染引起加工番茄条斑坏死病毒病。该病毒病在新疆为害明显上升,并有逐年加重趋势,严重影响了加工番茄的品质和产量,造成较大的经济损失。

以往对加工番茄病毒病的检测,是在发病高峰期集中一次进行。然而尚不清楚CMV和 ToMV在加工番茄生长发育期的发生消长动态,为此本研究于2009年利用RT-PCR法并结合历年资料对新疆天山北部地区加工番茄上的CMV和 ToMV的消长动态进行了研究,以明确CMV和 ToMV的消长动态,以期为今后加工番茄的抗病育种和制定防治措施奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集

1)不同地点采集样品:2009年6-9月,从石河子蔬菜研究所、石河子152团、玛纳斯县、昌吉三坪农场等6个地点田间自然发病及疑似病毒症状的加工番茄植株上采集138份样品。

2)不同时间不同品种采集样品:在石河子蔬菜研究所,从2009年6月1号开始,每隔10 d采集不同品种样品,每次每个品种采集10个样品,共660份样品。

1.1.2 实验试剂及质粒

实验试剂:TaqDNA聚合酶购自Promega公司、M-MLV反转录酶购自 TaKaRa公司;其它试剂均为国产分析纯。含CMV和 T oMV外壳蛋白基因(CP)的质粒由石河子大学农学院都业娟老师提供。

1.1.3 特异性引物

根据已报道的CMV和T oMV的外壳蛋白(CP)基因序列设计引物[4,9],其由上海生工合成(表1)。

表1 扩增CMV和 ToMV外壳蛋白(CP)基因特异片段的引物Tab.1 Primers for amplifying segments of the coat protein gene of CMV and ToMV

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取

总RNA的提取参照改良的LiCl方法[3]进行。

1.2.2 cDNA的合成

cDNA反转录在25μL体积中进行,取加工番茄组织总RNA 5μL、R9随机引物2μL、加无RNA酶的去离子水11μL、再依次加入以下试剂:1μL 10 mmol/L dNTP、4μL 5×第一链合成缓冲液、1μL Rnasin inhibitor(23 U/μL)、1μL M-MLV(200 U/μL)反转录酶。将以上试剂混匀后在25℃反应10 min,42℃延伸60 min,99℃5 min灭活M-MLV反转录酶。反应结束后将反转录产物保存于4℃或-20℃条件下,备用。

1.2.3 PCR扩增

PCR反应在25μL体积中进行。体系为:2μL 10×反应缓冲液1μL dNTP(10 mmol/L)、1μL 3′端引物(5 mmol/L)、1μL 5′端引物(5 mmol/L)、2μL cDNA 模板、1μL Taq DNA 聚合酶 (2 U/μL)、17μL ddH2O,混匀后于扩增仪上完成PCR反应,反应结束后将PCR产物保存于4℃或-20℃备用。CMV的扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s;53℃退火45 s;72℃延伸1 min,30个循环后72℃继续延伸10 min。T oMV的扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性45 s;52℃退火45 s;72℃延伸45 s,30个循环后72℃继续延伸10 min。取5μL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下进行观察。

2 结果与分析

2.1 不同地点CMV和ToMV的发生动态

针对 CMV 和 ToMV,用引物 C1/C2、To1/To2对在天山北部不同地点采集的138份加工番茄样品进行RT-PCR检测,并以CMV和 ToMV质粒的扩增产物作阳性对照,以加工番茄健康组织的扩增产物作阴性对照(图1、图2仅为所有样品RT-PCR检测的代表图)。结果表明:在石河子、奎屯、乌苏检测出CMV和 ToMV,其扩增产物分别为735 bp和689 bp的条带,均与阳性对照一致,但在阴性对照中未得到任何扩增产物,而在玛纳斯、昌吉、阜康的样品中未检测出CMV和 ToMV(表2)。

图1 CMV CP基因的RT-PCR扩增结果Fig.1 The RT-PCR analysis of the CMV CP gene

图2 ToMV CP基因的RT-PCR扩增结果Fig.2 The RT-PCR analysis of the TOMV CP gene

表2 不同地点CMV和ToMV的RT-PCR检测结果Tab.2 The results of CMV and ToMV were detectedby RT-PCR in the different regions

2.2 不同品种CMV和ToMV的发生状况

对石河子蔬菜研究所6个加工番茄品种的660份样品进行RT-PCR检测,结果表明:ToMV的单独侵染率较低,这主要与CMV复合侵染引起加工番茄条斑坏死有关。品种间2种病毒的检出率有一定差距,约50%,即 ToMV的发生率小于 CMV的发生率,CMV的检出率为21.5%,ToMV的检出率为12.1%,2种病毒的复合检出率为8.9%,但CMV和 ToMV在品种间的发生没有明显差异(表3)。

表3 不同品种CMV和ToMV的RT-PCR检测结果Tab.3 The results of CMV and ToMV were detected by RT-PCRfor the different varieties

2.3 不同时间CMV和ToMV的消长变化

对在石河子蔬菜研究所不同时间采集的660份加工番茄样品进行RT-PCR检测,结果表明:CMV比ToMV早发生10-15 d,CMV发生在6月25日左右,ToMV发生在7月11日左右。CMV的发生高峰期出现在7月下旬-8月下旬,ToMV的发生高峰期出现在8月中下旬,复合侵染发病期在7月下旬(表 4)。

表4 不同时间CMV和ToMV的检出率(%)Tab.4 The incidence of CMV and ToMV were in the different periods

2.4 不同年份CMV和ToMV的消长变化

根据资料(表 5)可以看出,2009年 CMV和T oMV的发生明显比2007和2008年低,与2006年比较接近,因此,初步认为与每年5-6月份的温度和雨量大小有一定关系。2009年6月份温度比往年同期低2℃左右,而雨量比往年同期多18～28 mm,而且2009年6-8月份温度均低于往年同期温度(表6)。

表5 不同年份CMV和ToMV的消长变化Tab.5 The population dynamics of CMV and ToMV were from different years

表6 不同年份石河子地区气象资料Tab.6 The meteorological data of Shihezi were from different years

3 结论与讨论

本研究结果表明,2009年新疆天山北部地区加工番茄病毒主要以CMV为主,ToMV次之,但2种病毒的发生明显低于往年。ToMV的单独侵染率较低,这主要是与CMV复合侵染引起加工番茄条斑坏死有关。CMV和 ToMV分别在6月25和7月11日左右开始发生,CMV比 ToMV早发生10-15 d。CMV的发生高峰期出现在7月下旬-8月下旬,ToMV的发生高峰期出现在8月中下旬,复合侵染发病期在7月下旬。

本研究检测的结果表明,2009年新疆加工番茄上CMV和 ToMV的发生明显低于往年,而 ToMV的发生低于CMV,同时又低于菜用番茄上病毒的发生。初步认为,一方面与加工番茄栽培方式的改变有关,另一方面与当年温度雨量的变化有关。新疆加工番茄病毒病害的发生严重程度与栽培措施有一定的关系,沟灌地比滴灌地发病重;移栽田发病重于直播田[12],而新疆加工番茄大多采用膜下滴灌栽培方式,并且加工番茄生长过程中打叉、抹芽等的田间操作很少,从而降低了接触传染的机率,进而大大减少了ToMV的发生。CMV在多年生宿根植物或杂草上越冬,主要通过蚜虫传毒,在蚜虫大发生的年份,病毒病害尤其严重。2009年5-6月份该地区雨水多温度偏低,与往年同期有较大差异,这不利于蚜虫等传播介体的迁飞,从而降低了CMV的发生程度。

[1]冯兰香,蔡少华,郑贵彬,等.我国番茄病毒病的主要毒原种类和番茄上烟草花叶病毒株系的鉴定[J].中国农业科学,1987,20(3):60-66.

[2]冯兰香,田如燕,杨翠荣,等.中国北方番茄主要病毒种类普查及 TMV、CMV株系鉴定[J].植物保护学报,1996,23(1):52-55.

[3]常波,向本春,刘升学,等.加工番茄条斑坏死病原黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析[J].石河子大学学报:自然科学版,2006,24(4):410-414.

[4]姜玉霞,向本春,安仙丽,等.新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子鉴定[J].新疆农业科学,2008,45(3):484-489.

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[7]Doolitlle S P.Anew infectiousmosaic disease of cucumber[J].Phytopathol,1918,6:145-147.

[8]Jagger I C.Experiments with the cucumber mosaic disease of cucumber[J].Phytopathol,1916,6:145-151.

[9]宋婷婷,陈荣溢.应用多重 RT-PCR检测烟草上的TMV和CMV[J].辽宁农业科学,2007(1):53-54.

[10]张新宇.新疆加工番茄病毒种类鉴定和分离物XJl087的株系鉴定[D].石河子:石河子大学,2007.

[11]许文博,都业娟,黄家风.加工番茄CMV与 ToMV的ELISA检测及其相关性分析[J].石河子大学学报:自然科学版,2009,27(2):199-201.

[12]张新宇,向本春,黄家风,等.新疆加工番茄病毒病害的调查[J].安徽农业科学,2007,35(18):5477-5478.

Population Dynamics of T omato Mosaic Virus and Cucumber Mosaic Virus of Processing T omato in the North of Tianshan Mountains in Xinjiang

ZHAO Xiangshu,XIANG Benchun,LIU Shengxue,DU Yejuan
(Key Laboratory of Oasis Crop Diseases Control,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S436.412.19

A

1007-7383(2010)05-0561-04

2009-12-11

国家科技合作与交流项目(20072072)

赵祥树(1984-),男,硕士生,专业方向为植物病理学;e-mail:zhaoxiangshu@stu.shzu.edu.cn。

向本春(1958-),男,教授,博士生导师,从事植物病毒及病害防治方面研究;e-mail:xbc@shzu.edu.cn。