新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增体系的优化

姜新,冯建荣,姜俊卿,王大江,刘月霞

(石河子大学农学院,石河子832003)

新疆杏品种自交不亲和S-RNase基因PCR扩增体系的优化

姜新,冯建荣,姜俊卿,王大江,刘月霞

(石河子大学农学院,石河子832003)

以3个新疆杏品种的叶片为试材,以其叶片基因组DNA为模板,分别对 PCR扩增体系中的 10×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、Taq DNA聚合酶和退火温度5个因素设计6个梯度,研究了新疆杏品种自交不亲和SRNase基因PCR扩增条件,建立其优化的PCR扩增体系。研究结果表明:其扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35个循环后72℃延伸10 min,25μL反应体系10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,dNTP 0.08 mmol/L,上下引物0.16μmol/L,DNA 80 ng,DNA聚合酶1μL,此为最优的反应体系。

杏;自交不亲和;S-RNase基因;体系优化

Abstract:In this experiment,the leaves of three Xinjiang apricot cultivas were used as test materials,and their DNAs were used as templates,6 levels of 10×buffer,primer,dNTP mixture,DNA polymerase and annealing temperature were set in this experimentation to study the PCR amplification conditions of self-incompatibility S-RNase gene in Xinjiang apricost and establish optimal PCR ampilification system.The results showed that the amplification program was 94℃predegradation for 5 min,94℃degradation for 45 s,52℃anneal for 45 s,72℃extension for 2 min,after 35 cycles 72℃extension for 10 min;the 25μL reaction mixture contained 10×Buffer(include Mg2+)2.5μL,dNTP mixture 0.08 mmol/L,each primer 0.16μmol/L,DNA 80 ng,Taq DNA polymerase 1μL,which is the optimum system.

Key words:apricot;self-incompatibility;S-RNase gene;PCR system;optimization

新疆是世界杏的起源中心之一,具有丰富的杏品种资源[1]。2005年新疆杏的栽培面积达到1.5×105hm2,鲜杏产量70万t,已经成为新疆仅次于葡萄、苹果的第三大果品。新疆杏加工和鲜食特性优良,具有良好的产业化前景。自治区“十一五”园艺发展规划,在2010年末新疆杏栽培面积要达到2×105hm2,届时杏将成为新疆首要的特色果品之一。

新疆杏品种都属于自交不亲和的品种,其自交亲和性普遍被认为属于S-RNase体系的配子体自交不亲和体系,受1个具有复等位基因的S-位点控制,S-位点至少包括2个基因,1个在花柱中特异表达,称花柱 S-RNase基因,另1个在花粉中特异表达,称花粉SFB基因。当雌雄性器官具有相同的S-等位基因时,交配不亲和,花粉管在花柱中生长受到抑制,不能延伸生长进入子房;当雌雄双方的 S-基因不同时,交配能亲和,花粉能顺利生长进入子房,完成受精[2]。研究建立优化的 S-RNase基因 PCR扩增体系有利于快速、准确的鉴定自交不亲和的SRNase基因型,为科学的配置杏授粉品种,提高杏的产量提供有利的技术支撑。

目前,关于利用特异引物PCR方法检测杏的自交不亲和S-RNase基因的报道有:Sutherland等[3]利用PCR技术对“Lambertin”等5个杏品种的S-基因进行了扩增;齐洁等[4]利用特异等位基因PCR方法鉴定了巴旦水杏(Prunus aremeniacaL.cv.Badanshui)、红玉杏(P.aremeniacaL.cv.Hongyu)及凯特杏(P.aremeniaca L.cv.Katy)3个品种的SRNase基因;冯建荣等[5]利用特异PCR技术成功地在凯特(P.aremeniacaL.cv.Katy)和新世纪杏(P.aremeniacaL.cv.Xinshiji)上鉴定出了3个新的SRNase基因;张立杰等[6]利用PCR方法比较分析了5对蔷薇科李属通用的引物组合对30个中国杏品种S-基因特异PCR的扩增效果。

本研究以新疆杏品种为试材,在前人的研究基础上进一步调整和优化PCR体系的各组份和扩增程序,旨在建立优化的新疆杏品种S-RNase基因的PCR扩增体系,为深入系统的研究新疆杏品种 SRNase基因型的鉴定提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材

本实验材料均采于新疆农业科学院轮台国家果树资源圃,品种名分别为:苏陆克、贝新纳尔、辣椒杏,五月底采集刚成熟的嫩叶洗净晾干后硅胶干燥保存备用。

1.1.2 试剂

10×Buffer(含Mg2+)和 Taq DNA聚合酶购自广东东盛公司 ;dNTP购买自加拿大Bio Basic Inc公司。引物均由上海生工合成。

1.2 方法

利用CTAB法提取杏叶片基因组DNA,50μL TE溶解DNA产物,紫外分光光度计检测DNA的浓度,-20℃保存备用。

1.2.1 PCR体系、程序及检测

本实验采用冯建荣等[5]报道的P系为参考体系,组分分别为:10×Buffer(含 Mg2+)2.5μL、dNTP 0.2 mmol/L、上下游引物:0.2 μmol/L(上游引物:5′-GGCCAAGTAATTATTCAAACC-3′,下游引物:5′-CATAACAAARTACCACTTCATGTAAC-3′)、 Taq DNA聚合酶 0.25μL、DNA 50～100 ng;扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35个循环后72℃延伸10 min。

PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,电压120 V,电泳时间为25 min,溴化乙锭染色。

1.2.2 实验设计

对体系中的4个组分和退火温度均设6个梯度,如表1所示。

在进行PCR扩增体系的优化过程当中,只调整单个试验因素的梯度水平,其他条件均按1.2.1中进行设置。

表1 体系中4种组分和退火温度梯度设计Tab.1 The gradient design of 4 compositions and annealing temperature of the system

2 结果与分析

2.1 10×Buffer(含Mg2+)浓度对 PCR结果的影响

结果见图1。

图1显示:梯度1～梯度4对3个新疆杏品种的PCR扩增效果呈明显的梯度差异,随浓度的增加扩增效果越来越好,但梯度4～梯度6的扩增效果却无明显的变化。从最佳的扩增效果和节省成本二方面判断,10×Buffer(含Mg2+)在梯度4时的浓度为最佳选择,为2.5μL。

图1 不同10×Buffer(含Mg2+)浓度时3个杏品种PCR扩增结果Fig.1 The amplification of PCR with different grads of 10×Buffer(Mg2+)for 3 apricot cultivars

2.2 dNTP浓度梯度对PCR结果的影响

结果见图2。

图2显示,6种dN TP浓度对3个新疆杏品种的扩增效果没有明显的差异,只有梯度1的扩增效果稍差,其它基本相同。由此可见,dN TP在梯度2时的浓度足以满足25μL PCR扩增体系中的需要,此时dNTP在体系中的浓度为0.08 mmol/L。

图2 不同dNTP浓度时3个杏品种的PCR扩增结果Fig.2 The amplification of PCR with different grads of dNTP for 3 apricot cultivars

2.3 引物浓度梯度对PCR结果的影响

结果见图3。

图3显示,6种引物浓度对3个新疆杏品种的扩增效果具有一定的梯度差异,从梯度1到梯度4扩增效果越来越好,从梯度4到梯度6扩增效果没有明显的变化,说明梯度4时引物的浓度已经可以满足25μL PCR扩增体系的需要,此时上下引物的浓度为0.16μmol/L。

图3 不同引物浓度时3个杏品种PCR扩增结果Fig.3 The amplification of PCR with different grads of concentrati f pims 3 ulv

2.4 Taq DNA聚合酶浓度梯度对PCR结果的影响

结果见图4。

图4显示,6种 Taq DNA聚合酶浓度对3个新疆杏品种的扩增效果无明显的梯度差异,只是在梯度1时扩增效果稍差,其它5个梯度对3个品种的扩增效果基本相同,因此,以节约成本为原则,选择梯度2时的浓度最好,此时,加入25μL体系中的Taq DNA聚合酶的用量为0.2μL。

图4 不同Taq DNA聚合酶浓度时3个杏品种PCR扩增结果Fig.4 The amplification of PCR with 6 different grads of concentration of TaqDNA polymarse for 3 apricot cultivars

2.5 退火温度对PCR结果的影响

结果见图5。

图5显示,不同的退火温度对新疆杏品种的PCR扩增结果差异较大。当退火温度较低时,如梯度1和梯度2,3个新疆杏品种的PCR扩增结果中均出现了非特异性条带;当退火温度较高时,如梯度4、梯度5和梯度6,3个新疆杏品种的 PCR扩增结果中的条带较暗甚至消失;而退火温度在梯度3时,3个新疆杏品种均扩出了清晰的2个条带。由此可见,梯度3时的退火温度为扩增新疆杏品种的最优退火温度,此时的退火温度为52℃。

图5 6种退火温度时3个杏品种PCR扩增结果Fig.5 The amplification of PCR with 6 different grads of concentration of Taq DNA polymerase for 3 apricot cultivars

3 讨论

目前,特异引物PCR技术已经广泛的应用于杏自交不亲和相关S-RNase基因的检测,并且在部分杏品种上已经成功的检测到了相应的S-RNase基因条带,与此同时关于扩增杏品种自交不亲和SRNase的PCR扩增体系也已经有了一定的研究,但这些研究大都针对欧洲品种群和华北品种群。本研究以新疆杏品种(中亚品种群)为研究对象,建立了一种适合新疆地区杏品种的自交不亲和S-RNase基因的扩增体系,为快速、准确的鉴定新疆杏品种的S-RNase基因型,科学配置授粉杏品种提供了有力的技术支撑。

由于在实际的DNA提取中,各个样品的获得率不完全相同,DNA浓度不可能完全一致,结果证实本实验所提取的DNA浓度都能满足PCR扩增的需要,而且它们之间的差异不会对PCR的结果产生影响。为此,在前人研究的基础上,本实验忽略了由于DNA浓度的差异对PCR结果产生的影响,只对 PCR体系中的 10×Buffer(含 Mg2+)、dNTP、上下游引物、DNA Taq酶、退火温度5个反应因子做了调整,同时本着最大限度降低成本的原则,从中选出了适合新疆杏品种PCR扩增的各因子的使用量或温度值。

通过比较,10×Buffer(含 Mg2+)、退火温度 2个因子与前人的报道没有变化,而dNTP、上下游引物、DNA Taq酶3个因子在用量上都有所降低,因此,本实验优化后的体系在完成新疆杏品种 SRNase基因扩增的同时,在实验成本上有所降低,为今后新疆杏品种S-RNase基因的研究提供了更为经济、有效的技术支撑。

4 结论

本实验所得出的扩增新疆杏品种S-RNase基因PCR优化反应体系程序为:94℃预变性5 min,94℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,35个循环后72℃延伸10 min;25μL反应体系成份为:10×Buffer(含 Mg2+)2.5μL,dNTP 0.08 mmol/L,上下引物0.16μmol/L,Taq酶1μL。

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Optimization of Self-Incompatibility S-RNase Gene PCR Ampilification System in Xinjiang Apricots

J IANG Xin1,FENGJianrong1,J IANGJunqing1,WANG Dajiang1,LIU Yuexia1
(College of Agriculture,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S611.2

A

1007-7383(2010)04-0418-04

2010-01-19

国家自然科学基金项目(30370992),国家高技术研究发展计划项目(2008AA10Z109),国家科技支撑计划项目(2007BAD36B06)

姜新(1983-),男,硕士生,专业方向为杏树种质资源与遗传育种;e-mail:jiangxin831105@163.com。

冯建荣(1969-),女,教授,从事果树种质资源与分子辅助育种研究;e-mail:fengjr102@126.com。