双酶分步水解制备花生多肽工艺优化

于丽娜，宫清轩，杨庆利*，孙 杰，毕 洁，张初署，于 洋

(山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

双酶分步水解制备花生多肽工艺优化

于丽娜，宫清轩，杨庆利*，孙 杰，毕 洁，张初署，于 洋

(山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

为了开发和利用花生蛋白资源，生产高附加值蛋白产品，以花生分离蛋白为原料，采用Alcalase和Flavourzyme分步水解法制备花生多肽。通过单因素试验和响应面中心组合设计试验，研究Flavourzyme水解花生分离蛋白过程中加酶量、底物质量分数、酶解温度、酶解时间和酶液pH值等因素对水解的影响。建立水解液中可溶性氮质量浓度与各种影响因素的回归模型；确定Flavourzyme酶解反应的最佳工艺参数为pH7.0、加酶量1714U/g底物、底物质量分数5%、酶解温度55℃、酶解时间90min。在此条件下，酶解产物中可溶性氮质量浓度为19.44mg/mL。

双酶分步水解；花生分离蛋白；花生多肽；制备工艺优化

我国是世界花生生产、消费和出口大国，花生种植面积和年产量均居世界前列[1]。花生的蛋白质含量为25%～30%，花生蛋白含有人体必需的八种氨基酸，精氨酸含量高于其他坚果，生物学效价高于大豆[2]。目前，中国对花生的利用多在食用油脂方面，对花生蛋白的利用较少。而国内市场上的花生蛋白产品主要是花生蛋白粉[3]，它主要作为食品加工的基础原料，进一步将花生蛋白粉加工制备成花生多肽的研究和产业化较少。多项研究表明，花生蛋白经蛋白酶水解制备成花生多肽后具有多种生理活性，包括抗氧化作用[4-7]、抗菌作用[8]、降血压作用[9-12]等。因此，研究花生蛋白粉酶解工艺制备花生多肽，可以开发和利用花生蛋白粉这一巨大的潜在蛋白资源，生产高附加值蛋白产品。本研究以脱脂花生蛋白粉制成的花生分离蛋白为原料，以Alcalase和Flavourzyme为工具酶分步水解制备花生多肽。主要对Flavourzyme水解工艺中的加酶量、底物质量分数、酶解温度、酶解时间和酶液pH值等影响因素进行了研究，确定了Flavourzyme水解花生分离蛋白的最佳工艺参数，旨在为花生多肽产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

一级脱脂花生蛋白粉 山东天申生物蛋白有限公司；Alcalase和Flavourzyme(食品级) Novozymes公司；Folin-Ciocalteu's phenol Reagent Sigma公司；牛血清白蛋白(分析纯) 北京索莱宝科技有限公司；酪蛋白(化学纯) 成都市科龙化工试剂厂；酪氨酸(BR) 国药集团化学试剂北京有限公司。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司；pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；双功能水浴恒温振荡器 金坛市杰瑞尔电器有限公司；Ultrospec 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 花生分离蛋白的制备方法

取花生蛋白粉以1:10的料液比溶于pH10.0的碱液中，40℃恒温水浴振荡浸提1.5h，以3000r/min离心10min，保留上清液，沉淀再经相同条件浸提、离心，合并两次上清液。上清液中加入酸调节pH值至4.50左右，静置0.5h后以3000r/min转速离心15min，取沉淀物经两次95%乙醇洗涤后，再用蒸馏水洗至中性，经冷冻干燥得到花生分离蛋白。

1.3.2 双酶分步水解花生分离蛋白制备花生多肽方法

首先用Alcalase水解花生分离蛋白，再用Flavourzyme继续水解的方法制备花生多肽。取花生分离蛋白粉加入蒸馏水，使之溶解后，放入90℃恒温水浴中保持20min，使花生分离蛋白钝化。取出后调节蛋白液的pH值为8.0，加入Alcalase，在55℃的恒温水浴振荡器中反应120min。反应结束后，调节蛋白液的pH值，加入Flavourzyme混合均匀，在一定温度的恒温水浴振荡器中反应一定时间，反应结束后立即取出，放入100℃水浴中保持5min，使酶失活，冷水冷却，测定水解液中可溶性氮含量。

双酶分步水解花生分离蛋白制备花生多肽工艺流程：

花生分离蛋白粉→蒸馏水→加热钝化→调pH8.0→Alcalase→55℃反应120min→调pH值→Flavourzyme→恒温水解反应→加热灭酶→水解液

1.3.3 双酶分步水解花生分离蛋白制备花生多肽试验设计方法

固定Alcalase水解花生分离蛋白条件，研究Flavourzyme水解花生分离蛋白的工艺条件。以加酶量、底物质量分数、酶解温度、酶解时间、酶液pH值作为试验因素，以酶解液中可溶性氮质量浓度作为考察指标进行试验设计。

1.3.3.1 单因素试验

单因素试验因素和水平如表1所示。单因素试验的基本反应条件：加酶量为1285U/g底物、底物质量分数4%、酶解温度55℃、酶解时间120min、酶液pH7.0。

表1 单因素试验因素和水平Table 1 Factors and levels in the single factor design

1.3.3.2 响应面(response surface methodology，RSM)中心组合设计试验

在固定酶液pH值条件下，根据单因素试验结果，采用响应面设计试验，运用Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，选择对酶解液中可溶性氮含量有显著影响的4个因素：加酶量(X1)、底物质量分数(X2)、酶解温度(X3)、酶解时间(X4)，进行四因素三水平的响应面分析试验，以酶解液中可溶性氮质量浓度作为响应变量(Y)，响应面试验设计因素水平及编码见表2。试验设计与分析采用Design-expert软件。

表2 响应面试验设计因素水平及编码Table 2 Factors and levels in the response surface design

1.3.4 酶活力测定方法

蛋白酶酶活力定义：1g蛋白酶在pH7.0或pH8.0，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1μg酪氨酸，定义为一个酶活力单位，以U/g或U/mL表示。具体用Folin-酚法测定[13]，取3支干燥的试管，分别标记为对照管和1号、2号管。在3支试管中分别加入磷酸缓冲液和蛋白酶液各1.0mL，然后，在对照管中加入0.4mol/L三氯醋酸溶液3.0mL，再向各管加入1%酪蛋白溶液1.0mL，在40℃水浴保温15min后，向1号和2号管加入0.4mol/L三氯醋酸溶液3.0mL。混匀后各管分别过滤，吸取滤液1mL，放在干燥的10mL带塞刻度试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.0mL，Folin-酚试剂1.0mL，混匀，于40℃水浴保温15min，然后，每管各加入3mL蒸馏水，混匀。用分光光度计在波长680nm处，以对照管为对照调“0”，测定两管的吸光度。并计算酶活力。

式中：m为根据样品所测定的吸光度，经查标准曲线求得的酪氨酸量/μg；t为酶促反应的时间/min；f为酶的稀释倍数。

1.3.5 可溶性氮含量测定方法

可溶性氮含量采用Lowery法测定[14]，取水解液1.0mL加入Folin-酚试剂A 5.0mL，混匀，于室温放置10min。再加入0.5mL Folin-酚试剂，加完后，立刻混匀，在30℃水浴保温30min。水浴结束后，用分光光度计在波长750nm处，以样品空白为对照调“0”，测定吸光度，根据酪氨酸标准曲线计算出可溶性氮含量。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶活力测定结果

试验中，Alcalase和Flavourzyme的稀释倍数为2000，经测定Alcalase和Flavourzyme活力分别为119040U/mL和85707U/g。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 加酶量对水解的影响

图1 加酶量对水解的影响Fig.1 Effect of enzyme amount on hydrolysis efficiency

水解液中可溶性氮质量浓度随着加酶量的增加总体呈现增加的趋势。加酶量增大，酶的水解作用加强，反应后水解产物增多。因此，水解液中可溶性氮质量浓度增加。但是，加酶量在1714U/g底物以后，可溶性氮质量浓度增加趋缓。所以选择加酶量在857～1714U/g底物作为响应面水平范围。

图2 底物质量分数对水解的影响Fig.2 Effect of substrate concentration on hydrolysis efficiency

2.2.2 底物质量分数对水解的影响水解液中可溶性氮质量分数随着底物质量分数的增加而呈线性增大趋势，且有很好线性相关性，其相关系数R2=0.9988。一般情况下，酶的饱和作用需要一定的酶解温度和酶解时间。在本试验条件下，经过一定的酶解温度和酶解时间作用后，不一定达到酶的饱和作用效果。因此，当底物质量分数增大时，有较多的底物与酶结合，水解产物增多，则水解液中可溶性氮含量增加。考虑到试验成本与水解产物的关系，选择底物质量分数在3%～5%作为响应面水平范围。

2.2.3 酶解温度对水解的影响

图3 酶解温度对水解的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis efficiency

酶的作用效果受到温度影响较大。一般情况下，在酶的适用温度范围内，增加反应体系的温度，则酶解的速度加快，酶解产物增多。如图3所示，在50～60℃温度范围内，可溶性氮质量浓度随着温度升高而增加。虽然在35℃和40℃时水解液中可溶性氮质量浓度较大，但是这两个温度不是酶的适用温度范围。而60℃又极易引起酶变性，因此，选择45～55℃作为响应面酶解温度水平范围。

2.2.4 酶解时间对水解的影响

图4 酶解时间对水解的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis efficiency

当加酶量、底物质量分数和酶解温度一定时，延长酶解时间，则水解产物应该增多。由图4可知，可溶性氮质量浓度在90min时为16.64mg/mL，在120min时可溶性氮质量浓度增加为16.8mg/mL，而后可溶性氮质量浓度下降再增加，在210min时可溶性氮含量为16.98mg/mL。可见，可溶性氮质量浓度在90min后增加趋缓，可能原因是当酶解温度固定时，一定量的酶只能水解一定数量的底物，即酶的作用达到饱和，再延长酶的作用时间，也不会使酶的作用加强。因此，选择90～150min作为响应面酶解时间水平范围。

2.2.5 酶液pH值对水解的影响

图5 酶液pH值对水解的影响Fig.5 Effect of pH on hydrolysis efficiency

酶液的pH值影响酶的水解效果，酶属于生物催化剂，它的水解都有自己最佳的pH值范围。如图5所示，随着酶液pH值的增加，水解液中的可溶性氮质量浓度呈现增加的趋势，在pH值为7.5时出现最大值。Flavourzyme的适用pH值在7.0左右，虽然pH值为7.5时水解液中的可溶性氮含量最多，考虑到花生分离蛋白的使用pH值在中性，所以，选取pH7.0作为响应面试验的固定pH值，而不带入响应面试验。

2.3 响应面试验设计及结果

对加酶量、底物质量分数、酶解温度、酶解时间4个因素分别在3个水平上对试验进行中心组合设计，共有30个试验点，其中包括16个析因点，6个中心点和8个轴向点。析因点代表自变量取值在X1、X2、X3、X44个变量所构成的三维顶点，轴向点代表了每个独立变量的极值水平，中心点代表中心水平，重复6次以估计试验误差。试验设计及结果见表3。

表3 Box-Benhnken响应面试验设计及结果Table 3 Box-Benhnken design layout and experimental results

利用Design-Expert软件对表3中的试验数据进行回归分析，以响应值为因变量，各因素及相互作用为自变量，对模型进行多次拟合，得到模型的回归方程为：

Y= 15.68＋0.11X1+2.88X2＋0.33X3－0.12X4＋0.079X1X2－0.027X1X3－0.094X1X4＋0.18X2X3－0.15X2X4－0.11X3X4+0.13X12＋0.0034X22－0.25X32＋0.0059X42

对该模型方程进行方差分析，其结果见表4。由二次多项式方程的方差分析表(表4)可知，响应面模型高度显著(P＜0.01)，表明该方程对实验结果的拟合情况良好，因此可以用该回归方程对试验真实值进行分析和预测。模型预测值和实际值之间具有高度的相关性，仅有约1.61%的数据变异不能用该模型解释(R2=0.9839)。同时，模型的变异系数仅为3.04%，也表明方程拟合度较好。影响因素X2和X3对可溶性氮质量浓度变化的影响是极显著的，X32对可溶性氮质量浓度变化的影响是显著的，影响因素的显著程度大小为X2＞X3＞X4＞X1，即底物质量分数＞酶解温度＞酶解时间＞加酶量。利用模型回归方程对试验的各个结果进行预测，结果见表3。试验值和预测值相差较小，也说明模型与试验数据的拟合性较好。但由于仪器误差和试验过程中的人为因素等的影响，导致个别试验误差较大，总体来说模型与试验数据的拟合性较好。

表4 响应面模型二次多项式方程方差分析表Table 4 Variance analysis for the fitted regression model

图6 各因素对可溶性氮质量浓度影响的趋势图Fig.6 Response surface diagrams showing the pairwise interactive effects of various factors on soluble nitrogen content in peanut protein hydrolysate

由回归方程也可以分析出，在影响可溶性氮质量浓度的因素中，加酶量、底物质量分数和酶解温度与可溶性氮质量浓度呈正相关，而酶解时间与可溶性氮质量浓度呈负相关。由图6可知，可溶性氮质量浓度随加酶量的增大而增加，但是变化趋势比较平缓；可溶性氮质量浓度随底物质量分数的增大而呈直线增加趋势，这与单因素试验结果一致，变化显著；可溶性氮质量浓度随酶解温度的升高而增加，变化显著；可溶性氮质量浓度随酶解时间的延长而减小，但是变化趋势比较平缓。

利用Design-Expert软件对实验模型进行典型性分析，获得最优的水解工艺条件：X1=1714U/g底物、X2=5%、X3=55℃、X4=90min，即加酶量1714U/g底物、底物质量分数5%、酶解温度55℃、酶解时间90min，在此条件下得到的可溶性氮质量浓度的理论最大值为19.59mg/mL。经过验证实验得出在此条件下，可溶性氮质量浓度19.44mg/mL，与理论值相比误差小于2%。

3 结 论

利用花生分离蛋白为原料，首先用Alcalase水解蛋白，再用Flavourzyme继续水解的分步水解法制备花生多肽。本实验主要研究了Flavourzyme水解蛋白的最佳工艺条件。通过单因素试验和四因素三水平中心组合设计试验，确定出底物质量分数和酶解温度对蛋白的水解影响极显著，各因素对水解的影响顺序依次为底物质量分数、酶解温度、酶解时间和加酶量；最佳的水解工艺条件：pH7.0、加酶量1714U/g底物、底物质量分数5%、酶解温度55℃、酶解时间90min。花生多肽具有很好的抗氧化、抑菌和降血压作用，利用Alcalase和Flavourzyme分步水解花生分离蛋白制备花生多肽是提高花生综合加工效益的有效途径，这种工艺技术的深入研究对我国花生蛋白精深加工技术的进步会起到很好的促进作用。

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Optimization of Stepwise Dual-enzymatic Preparation of Peanut Polypeptides

YU Li-na，GONG Qing-xuan，YANG Qing-li*，SUN Jie，BI Jie，ZHANG Chu-shu，YU Yang(Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China)

In order to exploit and utilize peanut protein resource and obtain high value-added protein products, defatted peanut protein powder was subjected to stepwise hydrolysis initially with alcalase followed by flavourzyme. The conditions for flavourzyme hydrolysis was optimized by response surface methodology in the present study. The effects of enzyme amount,substrate concentration, hydrolysis temperature, hydrolysis time and pH on soluble nitrogen content in peanut protein hydrolysate were explored by single-factor method, and a mathematical regression model describing soluble nitrogen content in peanut protein hydrolysate at different levels of four other factors except pH was established. The optimal process parameters for flavourzyme hydrolysis were found to be: pH, 7.0; enzyme amount, 1714 U/g substrate; hydrolysis temperature, 55 ℃; and hydrolysis duration, 90 min. Te soluble nitrogen content in the peanut protein hydrolysate obtained under the above conditions was 9.44 mg/mL.

stepwise dual-enzymatic hydrolysis；peanut protein isolate；peanut polypeptide；preparation optimization

TS201.1；TS229

A

1002-6630(2010)20-0220-06

2010-06-29

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAD97B04)；国家现代农业产业技术体系专项(nycytx-19)；

青岛市公共领域科技支撑计划项目(09-1-1-84-nsh)

于丽娜(1974—)，女，助理研究员，博士，研究方向为花生功能保健食品的开发与应用。

E-mail：lhtyln0626@yahoo.com.cn

*通信作者：杨庆利(1977—)，男，助理研究员，博士，研究方向为花生综合利用与加工。E-mail：rice407@163.com