甘肃省风疹病毒基因型分析

付 鸿，甄晓荣，陈 瑛，刘建锋，赵晓虹

（甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 兰州 730000）

甘肃省风疹病毒基因型分析

付 鸿，甄晓荣，陈 瑛，刘建锋，赵晓虹

（甘肃省疾病预防控制中心，甘肃 兰州 730000）

目的了解甘肃省2009年风疹病毒的分子生物学特征，确定其基因型别。方法用Vero/Slam细胞从风疹暴发和散发患者的标本中分离风疹病毒，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和序列测定与分析鉴定其基因型。结果甘肃省首次分离出的3株风疹病毒鉴定为1E基因型。与2株世界卫生组织1E基因型的参考株（T14-CH-02株、M1-MAL-01株）形成了一个分支，均属于1E基因型，核苷酸同源性为99%～100%。结论此次疫情是由1E基因型风疹病毒引起的暴发疫情，此项研究为以后甘肃省风疹病毒的分子流行病学研究奠定了基础。

风疹病毒；序列分析；基因型

风疹是由风疹病毒引起的急性呼吸道传染病，风疹病毒属于披膜病毒属，单链，正链RNA，只有一个血清型，人是其自然宿主。妊娠期妇女感染风疹病毒后，易引起婴儿先天性风疹综合征（CRS）。在托幼机构和中、小学校也常有风疹流行或暴发，危害青少年健康。目前，我国对风疹病毒的流行病学研究多集中在血清流行病学上，而对分子流行病学的研究相对较少。为做好发热出疹性疾病的病原学诊断，了解2009年甘肃省风疹暴发或散发疫情的风疹病毒分子生物学特征，现将分离到的风疹病毒进行基因型分析。

1 材料和方法

1.1 资料与标本来源

资料来源于暴发和散发病例5个县区甘肃省疾病预防控制中心（CDC）个案调查表及标本送检表，血清、咽拭子标本来自5个风疹暴发和散发的县区的22份标本。咽拭子标本冷藏送省CDC麻疹实验室进行病毒分离，分离血清进行风疹IgM抗体检测，22例患者的基本信息见表1。

1.2 麻疹、风疹IgM抗体检测

用捕获法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患者血清中的麻疹和风疹IgM抗体。检测采用广东省珠海市海泰生物制药公司生产的试剂盒，具体操作见试剂盒说明书。

1.3 风疹病毒分离方法

将处理后的标本液接种到长成单层的Vero/Slam细胞（非洲绿猴肾细胞/淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞）上，35℃吸附1h加维持液。随后在35℃培养，同时做好阴性细胞对照，盲传3代后送国家麻疹实验室进行风疹病毒鉴定[1]。

1.4 风疹病毒株的鉴定

将盲传3代的14株可疑风疹病毒再鉴定，序列测定和基因定型在国家麻疹实验室进行。国家麻疹实验室提取风疹病毒的RNA，用特异的PCR引物扩增EI基因，对PCR阳性产物的核苷酸片段进行序列测定和分析。

表1 22例患者基本信息

1.5 序列分析

调出世界卫生组织（WHO）参考株E1基因739个核苷酸序列，分别使用BioEdit7.0和MEGA3.0生物学软件对甘肃省分离到的3株毒株和参考株进行基因亲缘性关系分析和核苷酸变异分析。

2 结果

2.1 麻疹、风疹IgM抗体检测结果

对采集的22份患者血清标本进行麻疹和风疹IgM抗体检测。麻疹IgM抗体阴性；风疹IgM抗体10份阳性，可疑1份，11份阴性，但与实验室确诊的风疹病例有流行病学联系。

2.2 病毒分离结果

咽拭子标本，在Vero/Slam细胞上盲传3代后未见典型的细胞病变，收获、冻存于-70℃冰箱备用。

2.3 基因型鉴定结果

14株风疹病毒经RT-PCR检测，有3株鉴定为阳性标本。通过扩增风疹病毒E1基因的739个核苷酸片段和序列测定，分析证实为1E基因型（见表2）。

表2 3株风疹病毒鉴定结果及命名

2.4 基因亲缘关系和核苷酸变异分析

利用BioEdit7.0和MEGA3.0生物学软件对甘肃省2009年分离的3株风疹病毒与WHO RV 13个基因型的32株参考株相对应的核酸片段构建基因亲缘关系树（见图1）。此次在我省鉴定出的3株风疹病毒基因型与2株WHO 1E基因型的参考株（T14-CH-02株、M1-MAL-01株）形成了一个分支，均属于1E基因型，核苷酸同源性为99%～100%。

3 讨论

WHO建议将风疹和CRS的实验室监测纳入麻疹实验室网络中，病毒分离主要用于开展分子流行病学研究，鉴定病毒基因型，识别病毒来源和确定传播途径。

我国尚未全面开展系统的风疹和CRS的监测，但我省麻疹实验室已于2004年开始将风疹的实验室检测整合到麻疹监测中去，基于ELISA的风疹IgM抗体检测已基本成熟，2009年我省首次开展了风疹病毒的实验室分离工作。

图1 甘肃省3株风疹病毒株与WHO基因型构建的基因亲缘关系树

随着分子流行病学监测手段的不断发展与完善，我国已初步建立了风疹病毒毒株库和基因数据库。风疹病毒有3个重要的结构蛋白，分别为位于包膜上的E1和E2两种糖蛋白，和位于壳体上的非糖化蛋白C[2，3]。E1与风疹的血凝血融有关，又具有中和抗原作用，其基因全长1484bp，编码风疹大部分位于抗原表位，WHO将E1基因其中的739个核苷酸片段作为分子流行病学研究的序列[4，5]。根据我国1999～2002年对风疹病毒进行的分子流行病学研究，发现至少有4个基因型（1E、1F、2A、2B）曾在中国流行[6]。但近5年的研究表明[7]，1E基因型已取代其他基因型，逐渐成为RV优势流行基因型。

此次分离出的1E基因型是我省渭源县风疹暴发疫情，也是由1E基因型风疹病毒引起，这与我国近年来主要流行的风疹病毒基因型相符，未发生显著变异。此外，将我省此次鉴定出的风疹病毒基因型与近几年相邻省份（四川、宁夏、青海）[7，8]鉴定出的风疹流行病毒基因型比较，未发现明显的时间与地理分布倾向。

我国在风疹的病毒学检测方面还比较薄弱，而我省的检测工作属于起步阶段，此次研究为甘肃省风疹病毒的分子流行病学研究奠定了良好基础，为今后风疹病毒检测，建立甘肃省风疹病毒毒株库和基因数据库，鉴定甘肃省风疹病毒的传播源和传播链提供了科学依据。

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[6]朱贞，郭学斌，崔爱利.中国2007～2008年风疹流行和病毒基因特征分析[J].中国疫苗和免疫，2009，15（3）：201～204.

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1671-1246（2010）09-0113-03