三苯基锡对青萍生长及酶活性的影响

宋志慧，刘歌

青岛科技大学环境与安全工程学院，青岛266042

三苯基锡对青萍生长及酶活性的影响

宋志慧*，刘歌

青岛科技大学环境与安全工程学院，青岛266042

以青萍（Lemna mino）为实验生物，通过研究不同浓度（0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg·L-1）的三苯基锡（TPT）对青萍生长发育及过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性的影响，初步探讨了TPT对水生浮萍植物的毒性作用，以期为及时发现并排除TPT污染提供理论和直观依据.实验结果表明：培养4d后，TPT对青萍叶片生长量的半数抑制浓度（IC50）为0.10mg·L-1；CAT、POD活性随TPT处理浓度的升高显著升高（各暴露组与对照组均差异显著，p＜0.05）.结果显示，TPT对青萍具有明显的毒性作用，CAT和POD活性的变化可作为反映TPT污染胁迫的敏感指标.

三苯基锡；青萍；过氧化氢酶；过氧化物酶；IC50

1 引言（Introduction）

有机锡化合物作为人为引入环境的毒性最大的化合物之一（Lu et al.,2004），已经引起了人们的普遍重视.目前有机锡化合物已广泛存在于环境各介质中，许多国家均将其列为优先控制的有毒污染物（李红莉等，2003）.有机锡化合物不仅对水生生物具有严重影响，而且对陆生生物甚至人类都会产生危害.对水生生物影响最大的有机锡化合物主要是毒性较大的三丁基锡（TBT）和三苯基锡（TPT），它们会从船体防污油漆中直接释放到水中，使码头、湖泊、沿岸海域的水、沉积物和生物受到污染，同时研究表明，离岸较远的水域也会受到有机锡的污染（高峻敏和郑泽根，2003）.调查表明，一些地区对TPT杀菌剂的使用量越来越大，喷洒的TPT农药会随着雨水、径流等直接进入江河湖泊中，使地表水受到污染（Kannan and Lee,1996）.

浮萍科植物广泛存在于各种水体中，通常能够灵敏地反映水体污染状况，研究TPT对水生浮萍科植物生理指标的影响具有重要意义.青萍（Lemna minor）属浮萍科，具有分布广、繁殖快、易于打捞等优点，是水生毒理学研究中常用的实验材料，目前已被广泛应用于废水处理和水生植物污染生态学等研究中（Körner et al.,2003;Cheng et al.,1998;宋志慧和黄国兰，2005）.然而有关TPT对青萍的影响尚未见报道.

国内外许多学者已对TPT对海洋生物的毒性效应进行了很多研究（徐明德和杜春梅，2001;王永芳，2003;Botton et al.,1998），但对淡水生物的研究相对较少.本实验以青萍作为实验生物，通过不同浓度的TPT对青萍生长发育及抗氧化酶活性的影响，初步探讨了TPT对水生植物的毒性作用，以期为及时发现并排除TPT的污染提供理论和直观依据.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 实验材料

青萍（Lemna minor），采自福州某无污染荷花池，在此荷花池中检测未发现TPT的存在.挑选个体健壮、叶片完好的植株在光照培养箱中，（26±2）℃、14/10光暗比，（4000±100）Lux条件下用1/2 Hoagland培养液（Song and Huang,2005）培养.当青萍数量达到实验所需时，筛选出健康的植株，选择叶片数相同、生长状态一致的青萍进行毒性作用实验.

2.2 实验设计

实验以1/2 Hoagland培养液为稀释液，分别加入一定量的TPT，使TPT的浓度为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mg·L－1（以Sn计），以培养液为对照，在250mL烧杯中分别加入上述实验液100mL，每个浓度设3个重复，每个烧杯放40个叶片，实验进行4d，每2天换1次处理液,同时记录烧杯中的青萍叶片数.

2.3 实验方法

2.3.1 TPT对青萍的4d-IC50实验

根据实验所设浓度每2d纪录青萍叶片数.其4d的IC50的计算公式如下（Song and Chen,1998）：

速率Vt：

式中：t为时间（d）；Nt为时间t时青萍叶片数；N0为初始时青萍叶片数；Vt为时间t时的生长速率；In为染毒组的抑制百分率；Vn为染毒组处理n的生长速率；V0为对照组的生长速率.将In与实验液化合物浓度的对数进行线性回归，求出半数抑制浓度（IC50）.进行回归分析，其中，相关系数r为正值，为正相关；r为负值，为负相关；显著性水平p＜0.05为显著相关，p＜0.01为极显著相关.

记录青萍的植物体数时，为避免主观判断，判断标准为在10位放大镜下观察青萍，只要新的植物体伸出母体的边缘，就将其计算在内.对于老化而死亡、失去色素变白变黄的个体不记录.青萍植物体数的增加表示青萍的生长，各处理组与对照组的差异表示TPT对青萍的毒性效应（徐楠等，2002）.

2.3.2 TPT对青萍酶活性的影响

酶是活细胞内产生的具有高度专一性和催化效率的蛋白质，广泛存在于各种细胞中，催化细胞生长、代谢等生命过程中几乎所有的化学反应.过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）是生物体中广泛存在的酶，国内外大量研究表明，当植物处于逆境条件下，体内大量积累的活性氧可诱导膜脂过氧化，使细胞膜最先受到伤害.而POD和CAT是植物体内重要的保护酶系统，二者相互协调，可有效地清除代谢过程中产生的活性氧对脂膜的过氧化及其他伤害过程（宋美芳和李杰，2005）.本研究选择这两种酶作为指示TPT对青萍生理生化指标的影响.

实验悬浮液的制备（荆家海和丁钟荣，1981）：用电子分析天平称量青萍，加入2mL pH 6.4的0.2mol·L－1磷酸缓冲液，研磨后将研钵中的内含物用蒸馏水定容至50mL，保存在4℃下备用.为测定POD的活性，取25mL悬浮液用10%硝酸钙溶液定容至50mL，在定期摇动下停放30～40min后使用.

CAT的测定：取10mL青萍的酶悬浮液，加温到20℃后，加入5mL 0.1mol·L－1过氧化氢，经过5min后，加入5mL硫酸（1:9）终止反应后加入1mL 20%的碘酸钾，滴入3滴10%钼酸铵作为催化剂，在1mL 0.5%淀粉存在下，用0.02mol·L－1的硫代硫酸钠滴定，从而计算出酶的活性.过氧化氢酶的活性按参考文献（荆家海和丁钟荣，1981）进行计算.

POD的测定：取1mL左右的青萍的酶悬浮液置入干燥比色管中，加入7mL蒸馏水，1mL 0.3%愈创木酚，摇匀，浸入20℃水中，当对照试管的温度达到水浴温度时，加入0.5mol·L－1的过氧化氢溶液1mL.此后将溶液立即摇匀，并仍放入水浴中.加入过氧化氢后15min，用波长440nm比色皿厚度10mm的分光光度计，准确测定光密度.过氧化物酶的活性按参考文献（荆家海和丁钟荣，1981）进行计算.

2.4 统计方法

数据以均值±标准偏差表示.采用SPSS 16.0进行方差分析.

3 结果（Results）

3.1 TPT对青萍植株体生长的影响

TPT对青萍株体的毒性作用如表1所示.同一时间下，随TPT浓度的升高，青萍叶片数呈逐渐降低趋势，抑制百分率呈逐渐升高趋势，表明TPT对青萍生长具有明显毒性作用.

表1 TPT对青萍的毒性作用（叶片数）Table 1Toxic effects of TPT on Lemna minor（the number of leaf）

通过将TPT浓度的对数（lnC）为横坐标，抑制百分率为纵坐标做标准曲线，用图解法得到TPT对青萍4d的IC50值为0.10mg·L－1.

从实验结果可看出，在4d的处理时间内，随着处理浓度的增加，TPT对青萍生长的抑制作用逐渐增强，相比于对照组，各暴露组中青萍的生长速率明显下降.在实验过程中观察到，当TPT浓度高于0.12mg·L－1时，青萍周围出现白色沉积物，培养液变为白色浑浊物，青萍出现叶片轻微变黄，脱根和植株分离现象，浓度增大时，开始出现枯死叶片，到0.20mg·L－1时，叶片数开始停滞，新生叶片长不大.这主要是因为TPT主要通过根和叶吸收，并传导进入青萍体内，影响细胞分裂，从而造成青萍的生长停止.

实验结果说明，TPT对青萍生长具有明显的毒性作用，由于青萍等浮萍植物处于水生食物链的低端，因此TPT可能会通过生物浓缩现象经食物链的逐级放大传递给更高营养级的生物，甚至可能影响到人类的健康.

3.2 TPT对青萍抗氧化酶活性的影响

TPT对青萍CAT活性的影响如图1所示.从图1可以看出，相同培养液条件下，随着TPT处理浓度的增加，CAT活性显著升高，各暴露组与对照组均差异显著（p＜0.05）.

TPT对青萍POD活性的影响如图2所示.与CAT类似，相同培养液条件下，随着TPT处理浓度的增加，POD活性显著升高，各暴露组与对照组均差异显著（p＜0.05）.

CAT和POD作为生物体内的抗氧化系统酶，具有非常重要的生理功能，其中最为主要的就是参与活性氧代谢过程.在活性氧代谢过程中，CAT和POD可以使H2O2等过氧化物发生歧化生成水和氧分子（Van Breusegem et al.,2001），使其维持在低水平上，保护膜透性，减少植物受到的损伤（Gelain et al.,2008）.在环境胁迫等逆境情况下，生物体内广泛存在活性氧爆发现象，导致自由基增多，使细胞膜产生过氧化，导致细胞膜的破坏和损伤，而CAT和POD是体内清除自由基的酶促防御系统之一（Jin et al.,2008）.CAT和POD活性随TPT处理浓度显著增加是因为CAT和POD在TPT胁迫的逆境情况下机体为避免过氧化产生了大量CAT和POD，组成了酶促防御系统，保护了膜透性，从而减少了植物受到的损伤（马文丽等，2004）.

实验结果可以看出，0.04mg·L-1TPT污染即可导致青萍CAT和POD发生显著变化，因此青萍CAT和POD活性可作为反映水体TPT污染的敏感胁迫指标.

致谢：本论文得益于社会科学规划项目（03CJZ03）、山东省博士基金项目（03DS125）、山东省高等学校实验技术研究项目（2005-188），特此表示感谢.

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ToxicEffectsofTriphenyltinontheGrowthandtheRelated Enzymic Activities of Lemna minor

SONG Zhi-hui*，LIU Ge

College of Environment and Safety Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042

Toxic effects of triphenyltin（TPT）（0,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20mg·L-1）on the growth and the related enzymic（catalase（CAT）,peroxide（POD））activities of Lemna minor was researched in this study.Results showed that the 96h IC50of TPT for the number of Lemna minor’s leaf was 0.10mg·L-1.The CAT and POD activities increased significantly with the increasing of TPT concentrations（compared with the control,p＜0.05）.The results indicated that TPT has toxic effect on Lemna minor and the activity of CAT and POD can be used as the sensitive indicator of TPT in aquatic environment.

triphenyltin（TPT）；Lemna minor；catalase（CAT）；peroxide（POD）；IC50

25 February 2009accepted5 April 2009

1673-5897（2010）1-118-05

X171.5

A

2009-02-25录用日期：2009-04-05

山东省社会科学规划项目（No.03CJZ03）；山东省博士基金项目（No.03DS125）；山东省高等学校实验技术研究项目（No.2005-188）

宋志慧（1972—），副教授；*通讯作者（Corresponding author），E-mail:songhuey@sina.com

宋志慧（1972—），男，博士，副教授.