壬基酚长期暴露对斑马鱼雄鱼第二性征、精子活力的影响

夏继刚，牛翠娟，高颖，裴雪姣

北京师范大学生命科学学院生物多样性与生态工程教育部重点实验室，北京100875

壬基酚长期暴露对斑马鱼雄鱼第二性征、精子活力的影响

夏继刚，牛翠娟*，高颖，裴雪姣

北京师范大学生命科学学院生物多样性与生态工程教育部重点实验室，北京100875

研究了不同浓度下（0（对照）、0.1、1、10、100μg·L-1）壬基酚（NP）长期暴露对斑马鱼（Brachydanio rerio）雄鱼第二性征、精子活力的影响.结果表明，NP暴露对斑马鱼第二性征的影响显著，可导致雄性个体出现泄殖乳突、腹部膨大等典型雌性化特征.100μg·L-1NP暴露导致76.9%的雄鱼出现泄殖乳突.NP暴露对斑马鱼精子激活率的影响显著，随NP暴露浓度升高精子激活率下降，呈现负相关的剂量-效应关系.NP暴露对斑马鱼精子寿命和精子剧烈运动时间均有显著影响.低剂量（0.1μg·L-1）和高剂量（100μg·L-1）NP暴露下精子寿命及其剧烈运动时间显著缩短，而中等剂量（10μg·L-1）NP对上述指标影响不显著（p＞0.05）.斑马鱼第二性征、精子活力可作为指示水体环境雌激素毒理学效应的敏感指标.

壬基酚；第二性征；精子活力；斑马鱼

1 引言（Introduction）

环境内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs）对水生生物生命活动的影响以及对人类生殖健康的潜在威胁正日益引起人们的广泛关注.壬基酚（Nonylphenol,NP）是一种非离子表面活性剂，广泛应用于造纸、纺织、橡胶塑料、洗涤剂和化妆品等生产中，与人们的日常生活关系十分密切.NP也是壬基酚聚氧乙烯醚（NPEO）的降解产物，在污水处理后的水体中广泛存在（Ahel et al.,1994），愈来愈多的研究表明，NP具有雌激素活性，是一种环境内分泌干扰物（Jobling et al.,1996;Schwaiger et al.,2002;Chikae et al.,2003）.目前，大量有关NP内分泌干扰效应的文献报道集中于NP诱导的雄鱼睾丸退化、性激素水平的改变以及肝脏卵黄蛋白原生成等方面（Jobling et al.,1996;Schwaiger et al.,2002;Chikae et al.,2003;Kobayashi et al.,2005）.相对而言，有关NP对第二性征、精子活力等方面的研究报道较为少见（Hara et al.,2007）.

精子活力是评价精液质量的重要指标，良好的精子活力是进行成功受精的基础（Vladiĉ and Jarvi,1997;Kime et al.,1996）.有研究表明，鱼类精子对水体环境污染非常敏感，精子活力可作为敏感而精确的生物标志（biomarker），用于水体环境内分泌干扰物污染评价（Hara et al.,2007;Hashimoto et al.,2009;Singh et al.,2008;Nice,2005）.研究表明，17α-乙炔基雌二醇（EE2）暴露3周，可导致青鳉（Oryzias latipes）精子运动速率和精子激活率升高（Hashimoto et al.,2009）；NP短期暴露可导致青鳉精子运动速率和精子激活率下降（Hara et al.,2007）；2周NP暴露对青鳉精子运动速率的影响不显著（Kawana et al.,2003）；NP长期暴露可导致具有活动精子的牡蛎（Crassostrea gigas）数量显著减少（Nice,2005）.除精子活力外，鱼体第二性征也是水体环境内分泌干扰物监测敏感而可靠的生物标志（Bjerselius et al.,2001;Larsen et al.,2008）.

斑马鱼（Brachydanio rerio）是一种小型热带鱼，由于其世代周期短、产卵量大、易收集、易于大规模饲养等特点，现已成为经济合作与发展组织（OECD）常规试验鱼种，并作为模式生物被广泛用于化学品的各种毒性测试，是研究内分泌干扰作用的理想实验动物和水体污染监测的理想指示生物（Kime and Nash,1999;Kime,1999）.然而，内分泌干扰物对斑马鱼精子活力的影响尚不完全清楚，尚未见NP暴露对斑马鱼雄鱼第二性征、精子活力影响的文献报道.为进一步探索NP的环境雌激素效应，并筛选生物标志物，本文研究了NP长期暴露对斑马鱼雄鱼第二性征、精子活力的影响.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 实验动物与试剂

斑马鱼种鱼由北京大学斑马鱼中心提供，实验用鱼为经过本实验室多代培养的纯种品系，饲养方法参照Westerfield（1995）.实验条件：实验用水为充分曝气脱氯并经活性炭过滤的自来水，水温（25±1）℃，pH 7.8±0.03，光周期14L:10D，ρ＜1g·L－1，每日投喂2次冰冻红虫，投喂15min后，吸去残饵.选取120d以上，健康状况良好的斑马鱼进行实验，平均体重（0.406±0.003）g（n=90）.

壬基酚（NP,Sigma公司），以丙酮（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）为助溶剂，配制成10mg·mL－1的NP母液，并稀释到相应浓度，4℃避光保存，待用.对照组丙酮浓度为10μL·L－1，低于Hutchinson等（2006）所推荐的最大浓度.

2.2 暴露处理

暴露容器为24cm×18cm×20cm的方形玻璃缸.为避免产生应激反应，正式暴露试验前，使鱼群处于试验环境条件下，驯养适应2周.实验设5个浓度梯度：0、0.1、1、10、100μg·L－1.每个梯度随机放入健康活泼的斑马鱼雄鱼15尾，每个处理设3个平行组.采用半静态暴露装置，每日换水50%，持续暴露70d.

2.3 第二性征

斑马鱼雌雄分别具有以下典型特征（Laale,1977;Larsen et al.,2008）：①体型：雌鱼身体比雄鱼粗壮，尤其是腹部膨大，体圆，各鳍均比雄鱼短小，但不明显；雄鱼体细长扁平，呈杆形，没有明显突出的腹部.雌鱼的体高/体长比要明显高于雄鱼.②体色：雌鱼的蓝色条纹偏蓝而鲜艳，间以银灰色条纹；雄鱼蓝色条纹偏黄，间以柠檬色条纹.③泄殖乳突（Urogenital papillae）：此为雌鱼所具有的典型特征，雄鱼无.暴露60d后，检查各处理组鱼的第二性征并拍照，有改变计为“1”，无改变计为“0”.

2.4 精子活力

参照文献（刘鉴毅等，2007;Alavi et al.,2006），用激活率、剧烈运动时间、总运动时间（精子寿命）等指标来评价精子活力.激活率以显微镜下同一视野中的活动精子百分比表示；剧烈运动时间是指从精液与激活液混合开始，到约70%运动精子转入缓慢运动为止的时间；总运动时间是指从精液与激活液混合开始，到视野中约90%的精子停止活动或原地震颤为止的时间.

暴露70d后，显微镜下观测精子活力.用移液枪吸取各浓度溶液10μL于干燥洁净的载玻片上，调节好显微镜，用解剖针尖从性腺蘸取少许精液涂在载波片上，与溶液混匀，即刻于10×20倍显微镜下观察精子活动情况，并用秒表记录各运动阶段的时间.每尾鱼重复2次.实验室温（26±1）℃.由于寄生虫感染也会导致动物生理过程的破坏，从而干扰药物的作用效应（Hinton et al.，1992），实验结束后，在解剖镜下解剖并检查每条鱼的疾病及寄生虫感染情况.

2.5 数据处理

应用软件SPSS for Windows 16.0进行统计分析.对数据进行正态性检验后，用单因素方差分析（ANOVA）和LSD多重比较检验差异显著性；χ2-检验对比率数据进行统计分析；线性回归分析精子激活率与暴露浓度的关系.各组数据均用平均值±标准误表示，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著.

3 结果（Results）

经解剖检查，未发现有明显寄生虫感染的动物个体.对精子活力的观察，100μg·L－1NP处理组样本大小为n=11，其余各组n=15.

3.1 第二性征

NP暴露对斑马鱼雄鱼第二性征的影响显著，可导致雄性个体出现泄殖乳突（χ2=53.48;p＜0.01）、腹部膨大（χ2=44.67;p＜0.01）等典型雌性化特征（表1，图1）.100μg·L－1的NP暴露导致76.92%的雄鱼出现泄殖乳突（p＜0.01）；浓度高于10μg·L－1的NP暴露可以显著改变雄性斑马鱼的体型，导致腹部膨大（p＜0.05）.

表1 NP暴露60d对斑马鱼雄鱼第二性征的影响Table 1Secondary sexual characteristics of male zebrafish after being exposed to different NP concentrations for 60 days

3.2 精子活力

NP暴露对斑马鱼精子激活率的影响显著（χ2=118.6；p＜0.01）.随NP暴露浓度的升高，精子激活率逐渐下降，100μg·L－1NP暴露导致精子激活率极显著下降（p＜0.01）（图2）；NP暴露浓度与精子激活率呈现显著负相关的剂量－效应关系（图3）.

NP暴露对斑马鱼精子剧烈运动时间的影响显著（F=5.90;p＜0.01）.随NP暴露浓度的提高，精子剧烈运动时间表现为低剂量（0.1μg·L－1）下减少（p＜0.05），中高剂量（1、10μg·L－1）有所回升差异不显著，高剂量（100μg·L－1）下极显著减少（p＜0.01）（图4）.

NP暴露对斑马鱼精子寿命的影响显著（F=11.31;p＜0.01）.低剂量组（0.1μg·L－1）与高剂量组（100μg·L－1）精子寿命均极显著缩短（p＜0.01），而中高剂量组（10μg·L-1）与对照组相比并无显著性差异（p>0.05）（图5）.

4 讨论（Discussion）

4.1 第二性征

鱼类的第二性征是由体内雄激素和雌激素的平衡所调控的（Kime,1998）.内分泌干扰物暴露可以导致鱼类第二性征的改变（Bjerselius et al.,2001;Larsen et al.,2008;Brion et al.,2004;Toft and Baatrup,2001），17β-雌二醇水体暴露可导致全部雄性金鱼失去追星（Tubercles）（Bjerselius et al.,2001）；Brion等（2004）的研究表明，25ng·L-117β-雌二醇暴露3周可诱导斑马鱼雄鱼出现泄殖乳突，且随着剂量的升高出现比例增大；Larsen等（2008）的研究表明，EE2对斑马鱼泄殖乳突的影响显著，0.05ng·L-1EE2暴露就可导致出现泄殖乳突的比例显著升高，同时，5.00ng·L-1高浓度EE2暴露可导致雄鱼体圆、腹部膨大.长期的内分泌干扰物暴露可能通过作用于下丘脑-垂体-性腺轴，持续干扰促性腺激素的合成与分泌，进而破坏动物体内雄激素和雌激素的平衡，最终导致第二性征的改变.本文的研究结果与上述文献报道相一致.斑马鱼第二性征可作为指示水体内分泌干扰物的敏感指标，用于环境监测.

4.2 精子活力

鱼类精子是一类分化程度很高的细胞，由于精巢和精浆中存在抑制因子，精子在精巢中不活动，一旦排入水中，精子便立即被激活而开始运动（Hara et al.,2007）.精子的运动是靠其尾部鞭毛的摆动，外界环境因子对鱼类精子活力的影响，主要是通过影响cAMP-ATP-Mg2+系统来影响鞭毛的活动而实现（Hoar et al.,1978）.精子活力的评价指标主要有精子激活的比例、精子激活后的运动时间、精子运动的激烈程度等（Alavi et al.,2006）.Hara等（2007）发现NP短期暴露导致青鳉精子激活率下降；Nice（2005）的研究结果表明，NP对牡蛎精子活力的影响具有明显的剂量-效应关系，1μg·L-1和100μg·L-1NP暴露可分别导致具有活动精子的牡蛎数从100%下降到30%和12.5%；Kinnberg等（1999）指出，NP可能通过破坏动物体内性激素水平的平衡影响到睾丸支持细胞（Sertoli cells）的正常功能，进而影响精子质量，Sertoli cells以其独特的结构和功能为精子发生提供适宜的微环境，并为生精细胞提供营养支持，对生精细胞发育和活动具有至关重要的调控作用.此外，精子激活率的降低也可能是由于内分泌干扰物暴露导致精子畸形、缺少鞭毛或鞭毛运动受到抑制造成的（Rurangwaetal.,2002;McAllisterandKime,2003）.本研究中，NP暴露对斑马鱼精子激活率的影响显著，随NP暴露浓度升高，精子激活率逐渐下降，呈显著负相关的剂量-效应关系.研究结果与Nice（2005）和Hara等（2007）相一致.

精子运动的时间长短以及剧烈程度具有十分重要的生物学意义，与哺乳类相比，鱼类精子激活后运动时间很短，精子必须在有限时间里找到和进入受精孔（Billard,1978）.本文实验中，NP暴露对斑马鱼精子寿命和精子剧烈运动时间的影响均显著，并表现为低剂量（0.1μg·L-1）和高剂量（100μg·L-1）下显著缩短，而在中等剂量（10μg·L-1）暴露浓度下影响不显著，提示NP暴露对精子活力的影响可能具有低剂量-效应（Welshons et al.,2003）.NP对精子活力影响的作用机制在高剂量和低剂量下可能不同，低剂量下精子寿命和剧烈运动时间的缩短可能是由于内分泌干扰物暴露促使精子运动速率增加，从而导致精子储存能量的快速耗竭所造成的（Hashimoto et al.,2009），而高剂量下精子活力的下降可能是内分泌干扰物暴露直接导致精子细胞线粒体呼吸作用受到抑制、能量代谢受阻、鞭毛运动受到抑制所致（Rurangwa et al.,2002;McAllister et al.,2003）.有关NP暴露对斑马鱼精子形态学、精子运动速率、精子能量代谢及精液成分的影响有待于进一步研究.

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Effects of Long-Term Exposure to Nonylphenol on Secondary Sexual Characteristics and Sperm Motility of Male Zebrafish（Brachydanio rerio）

XIA Ji-gang，NIU Cui-juan*，GAO Ying，PEI Xue-jiao

Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering,College of Life Sciences,Beijing Normal University,Beijing 100875

The present work examined the effects of long-term exposed to different nonylphenol（NP）concentrations（0（control）,0.1,1,10,100μg·L-1）on secondary sexual characteristics and sperm motility of male zebrafish（Brachydanio rerio）.Results showed that male secondary sexual characteristics were significantly affected by NP exposure,showing visible urogenital papillae and bulgy abdomen,which belong to the female.76.9%males were feminised with development of urogenital papillae at 100μg·L-1NP.Sperm activation rate showed a negative correlation with NP concentration.NP exposure also showed marked influence on acute movement time and longevity of the zebrafish sperm.Both the above two parameters were clearly shorter at low-dose（0.1μg·L-1）and high-dose（100μg·L-1）treatment comparing with the control.However,it was similar with the control at medium-dose（10μg·L-1）.The results suggested that the secondary sexual characteristics and sperm motility of male zebrafish might be used as the sensitive indexes of aquatic environmental endocrine disrupting chemicals.

nonylphenol；secondary sexual characteristics；sperm motility；zebrafish

20 April 2009accepted2 June 2009

1673-5897（2010）1-044-06

X171.5

A

2009-04-20录用日期：2009-06-02

国家自然科学基金重点项目（No.40632009）

夏继刚（1980—），男，博士；*通讯作者（Corresponding author），E-mail:cjniu@bnu.edu.cn

牛翠娟（1965—），女，1992年获日本北海道大学博士学位，2000年起担任北京师范大学生命科学学院教授、博士生导师.2004年至2005年加拿大University of British Columbia访问学者.长期从事水生生物生理生态与生态毒理学研究.主持或参加国家自然科学基金项目、国家863计划项目，国家重大基础研究计划项目（973）等20余项，发表论文近百篇.