大鼠服用朱砂后脑内氨基酸类递质含量的变化

丁敬华,吴 辉,张颖花,陈再兴,畅 蓓,石松田,姜 泓

(1.中国医科大学公共卫生学院,辽宁沈阳110001; 2.中国医科大学药学院,辽宁沈阳110001)

大鼠服用朱砂后脑内氨基酸类递质含量的变化

丁敬华1,吴 辉1,张颖花1,陈再兴2,畅 蓓1,石松田1,姜 泓1＊

(1.中国医科大学公共卫生学院,辽宁沈阳110001; 2.中国医科大学药学院,辽宁沈阳110001)

研究了朱砂对大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的影响.将32只Wistar大鼠随机分为低、中、高剂量组和对照组,朱砂灌胃给药14天后,采用高效液相色谱法测定大鼠脑组织中谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)和牛磺酸(Tau)的含量,并计算兴奋毒性指数(EI)的变化.与对照组相比较,脑组织中氨基酸类神经递质含量均呈下降趋势,其中Asp和 Gly的中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05),Tau和 GABA的高剂量组有统计学差异(P<0.05),Glu和 EI所有剂量组均有统计学差异(P<0.05).朱砂对氨基酸类神经递质具有一定的抑制作用.

朱砂;大鼠;脑组织;氨基酸类递质

朱砂(cinnabar)最早见于我国第一部药物学专著《神农本草经》,具有清心镇惊,安神解毒之功效,是常用中药,临床应用广泛,主要用于治疗心悸易惊,失眠多梦,癫痫发狂,小儿惊风,视物昏花,口疮,喉痹,疮疡肿毒[1].虽然朱砂在中医用药中占有重要地位,但是随着汞毒性研究的进展和人们对食品药品安全卫生问题的日益重视,含汞中药朱砂潜在的毒性也越来越引起人们的关注.祖国医药学对朱砂毒性的认识,经历了由“无毒”到“有毒”,到目前“限量”使用的过程,《本草备要》记载“朱砂多服令人痴呆”.中枢神经系统内大部分神经递质是氨基酸类神经递质,谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和牛磺酸(Tau)是脑部重要的神经递质,这些氨基酸类神经递质含量的变化可以反映出许多疾病的病理、生理过程[2-5].因此,测定这些氨基酸类神经递质含量变化对于研究朱砂对神经系统的毒/药理机制具有极其重要的参考价值.

1 实验部分

1.1 药品、材料与仪器

市售朱砂,胃蛋白酶(活度1∶3 000,美国华美生物工程公司),考马斯亮蓝蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所),Glu、Asp、GABA、Gly和 Tau(Sigma公司),甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯.Wistar大鼠32只(中国医科大学实验动物部提供),体重150±10 g,雌雄各半.

高效液相色谱仪(美国Waters公司),包括600泵,2475荧光检测器;ER-182A全自动电子天平 (十万分之一)(日本A&D公司);组织匀浆器(IKA广州仪科实验室技术有限公司);3K-18超速冷冻离心机(Sigma公司);p H-3c型酸度计(上海精密科学实业有限公司);722s型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);KQ-218超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Easypure纯水系统(美国Barnstead公司).

1.2 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18柱(150 mm ×4.6 mm,5μm);流动相:A相为甲醇,B相为0.1 mol/L醋酸钾溶液,流动相均以0.45μm滤膜过滤,超声脱气后使用,梯度洗脱为0～2 min内A相从20%线性增加至47%,2～11 min内从47%增加至53%,11～14 min内增加至100%,然后以A相洗脱5 min,再以A相20%平衡5 min.流速:1.0 mL/min;检测波长:λex=250 nm,λem=395 nm;柱温:35 ℃.进样量:20μL.

1.3 衍生试剂和标准溶液的配制

将20 mg邻苯二甲醛(OPA)、0.5 mLβ-巯基乙醇溶于0.5 mL甲醇中,再加入9 mL硼酸缓冲液 (0.4 mol/L p H 10.5)制得衍生试剂,室温下密封,避光保存.

准确称取氨基酸标准品适量,用1 mmol/L NaOH溶解,稀释,配成氨基酸混合标准贮备液(Glu、Asp、GABA和 Tau浓度为800μmol/L,Gly浓度为200μmol/L),用时稀释.取氨基酸标准贮备液100μL,加入衍生试剂200μL,混匀,静置2 min,进样,以保留时间定性,峰面积外标法定量.

1.4 分组及给药方法

Wistar大鼠32只,体重150±10 g,雌雄各半.按体重随机分成4组,每组8只.以0.3%CMC-Na水溶液为混悬介质,对照组(0.3%CMC-Na水溶液)、实验用药组(1 g/kg,2 g/kg,4 g/kg)灌胃给药,每日1次,灌胃14天.在动物灌胃期间每3天称重1次,调节灌胃剂量.所有动物均自由饮水和进食普通饲料.

1.5 样品采集及处理

最后一次灌胃2 h后,10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,迅速开颅取大脑(冰浴下进行).取脑组织100 mg,加9倍预冷生理盐水匀浆5 min,冰浴下超声脑组织,4℃离心(3 500 r/min)20 min,取上清液,稀释,精密吸取100μL稀释液加考马斯亮蓝溶液5 mL,进行蛋白定量.另取上清液4℃离心(10 000 r/min)20 min,稀释,精密吸取稀释液100μL,加OPA衍生试剂200μL,混匀,静置2 min.注入高效液相色谱仪中进行梯度洗脱.

1.6 兴奋性毒性指数(EI)的计算[6]

1.7 统计分析

实验所得数据以平均值±标准差表示,用SPSS12.0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验.

2 结果与讨论

2.1 氨基酸的标准曲线

五种氨基酸在本实验条件下15 min内得到较好分离,色谱图见图1.

图1 5种氨基酸的 HPLC图Fig.1 HPLC graph of 5 amino acids

以进样量(x)对样品的峰面积(y)进行回归,求得回归方程,结果 Glu在2～20μmol/L范围内线性关系良好(y=402 914.16+513 719.34x,r=0.997 2);Gly在0.5～5μmol/L范围内线性关系良好(y=341 276.99+178 754.48x,r=0.999 9);Asp在2～20μmol/L范围内线性关系良好(y=-64 381.36+221 665.87x,r=0.993 0);GABA在 2～20μmol/L范围内线性关系良好(y=-235 426.96+869 648.80x,r=0.999 4);Tau在2～20μmol/L范围内线性关系良好(y=197 068.59+1 028 694.44x,r=0.999 3).

2.2 朱砂对大鼠脑组织氨基酸含量及兴奋毒性指数的影响

对大鼠连续灌胃14天后,脑组织中氨基酸类神经递质含量(表1)均呈下降趋势.与对照组相比较,Asp和Gly的中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05),Tau和 GABA的高剂量组有统计学差异(P<0.05),Glu和EI所有剂量组均有统计学差异(P<0.05).

表1 脑组织中氨基酸含量测定结果Table 1 Contents of amino acids in brain

2.3 色谱条件和衍生化条件的选择

本研究采用OPA柱前衍生、反相高效液相色谱-荧光检测法对氨基酸进行梯度洗脱和含量测定,经方法学考察,结果灵敏、可靠.

OPA柱前衍生化具有高度灵敏性,但衍生产物不稳定,故实验过程中要严格控制反应时间,结果表明2 min时较为稳定,故在实验中,以衍生化试剂加入起计时到2 min时进样.另外,OPA试剂本身无荧光,过量加入以保证衍生反应完全,且对实验结果无影响.

2.4 实验结果分析

实验结果表明大鼠服用朱砂后脑组织中5种氨基酸含量均呈降低趋势,GABA和 Glu是中枢神经系统内最重要的氨基酸类神经递质.Glu为兴奋性神经递质,具有神经毒性,降低趋势较明显,其主要原因可能与朱砂镇静安神的功效有关,另一方面可能是由于朱砂中汞的毒性使大鼠处在应激状态下,中枢神经系统Glu含量降低可以视为机体自身的保护机制[6],具体原因有待于进一步研究.GABA是以 Glu为底物经谷氨酸脱羧酶脱羧而成,具有抗焦虑和抗惊厥的作用,是脑内主要的抑制性神经递质.GABA降低的原因一方面可能是由于底物 Glu含量的降低,而使 GABA的含量降低.

另一方面的原因可能是脑内的一种被动的自身性保护作用,纠正中枢神经兴奋性/抑制性神经递质比值,减轻毒性作用引起的神经细胞损害,但二者(兴奋性神经递质和抑制性神经递质)仍处于一种失衡状态.Tau有多种生理功能,如促进大脑智力发育、改善学习记忆能力、抗脂质过氧化、对抗各种化学物质对细胞的损害等作用[7],Tau含量的降低是朱砂的神经系统毒性的表现之一.

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2005:92.

[2]Niswender C M,Conn P J.Metabotropic glutamate receptors:physiology,pharmacology,and disease[J].A nnual Rev Pharm Toxic,2010,50(2):295-322.

[3]Francis P T.Altered glutamate neurotransmission and behaviour in dementia:evidence from studies of memantine[J].Current Molec Pharm,2009,2(1):77-82.

[4]Moult P R.Neuronal glutamate and GABAA receptor function in health and disease[J].Biochem Sco Trans,2009,37(6):1317-1322.

[5]Oja S S,Saransaari P.Pharmacology of taurine[J].Pro West Pharmacol Soc,2007,50(1):8-15.

[6]刘宗文,张艳,贾丹辉,等.阿米替林对脑缺血再灌注大鼠大脑皮质中氨基酸类神经递质的影响[J].中国药学杂志,2008,43(17):1305-1308.

[7]Kita I,Seki Y,Nakatani Y,et al.Corticotropin-releasing factor neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus are involved in arousal/yawning response of rats[J].Behav B rain Res,2006,169(1):48-56.

Effects of Cinnabar on Content of Amino Acids Neurotransmitters in Brain Tissues of Rats

DINGJing-hua,WU Hui,ZHANG Ying-hua,CHEN Zai-xing,CHANG Bei,SHI Song-tian,J IAN G Hong
(1.School ofPublic Health,China Medical University,Shenyang110001,Liaoning,China;2.School of Pharmaceutical Sciences,China Medical University,Shenyang110001,Liaoning,China)

The effect of cinnabar on the content of amino acids neurotransmitters in rat brains was investigated.Thus 32 Wister rats were categorized into 4 groups randomly,8 rats each group,including low dosage group,moderate dosage group,high dosage group,and control group.The three groups of to-be-tested rats were treated with cinnabar by gastric perfusion at a dosage of 1 g/kg,2 g/kg,and 4 g/kg;and the control group ones were allowed to orally take the same volume of 0.3%sodium carboxymethylcellulose(CMC-Na).After 14 day treatment,the content of glutamate(Glu),aspartate(Asp),glycine(Gly),γ-aminobutyric acid(GABA)and taurine(Tau)in brain tissues of the rats were determined by means of high-performance liquid chromatograph;and the variation of excitation toxicity index(ETI)was calculated.Results indicate that,as compared with the rats of control group,the content of amino acids neurotransmitters in the brain tissues of the three groups of tested rats tends to decrease,which indicates that cinnabar has some inhibition action to amino acids neurotransmitters.Namely,the content of Glu in the brain tissues of all the three tested groups of rats is significantly decreased(P<0.05),that of Asp and Gly is significantly decreased at a dosage of 2 g/kg and 4 g/kg(P<0.05),and that of Tau and GABA are significantly decreased at a dosage of 4 g/kg(P<0.05),showing statistical significance.

cinnabar;rat;brain tissues;amino acids neurotransmitters

O 613.63

A

1008-1011(2010)05-0082-03

2010-05-14.

辽宁省自然科学基金资助项目(20092133).

丁敬华(1982-),女,硕士生,研究方向:含重金属矿物药毒作用机制研究.＊

,E-mial:jianghong@mail.cmu.edu.cn.