精清去除方法对崂山奶山羊精液冷冻保存效果的影响

程 明 ，李建栋 ，赵金山 ，汪文鑫 ，江 科 ，戈 新

（1.青岛市畜牧兽医研究所，山东 青岛 266100；2.青岛农业大学，山东 青岛 266109）

随着规模化养羊业的快速发展，精液保存逐渐成为制约羊人工授精技术推广及良种推广的技术瓶颈。目前，生产中仍以现采现用或常温短期保存为主，超低温保存仍处于研究阶段。崂山奶山羊是我国的优良地方品种，2002年曾作为日生礼物由朱基总理代表中国政府赠送给泰国王后。近年来，随着青岛都市化进程的不断加快，崂山奶山羊也逐渐向规模化舍饲发展，否则将面临灭绝的危险，精液冷冻作为繁殖手段和保种手段显得非常重要。目前有关山羊精液冷冻保存的研究中仍主要使用含卵黄的稀释液[1-3]，而是否去除精清和去除方法各有不同[1-5]。关于崂山奶山羊的精液冷冻保存尚未见报道。本试验对几种去除精清的方法进行了比较研究，以期获得好的精液保存效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 崂山奶山羊公羊，1.5～2岁，身体健康，膘情适中，性欲旺盛。所有试验羊均来自青岛崂山奶山羊原种场，采用标准饲养管理。

1.1.2 试验器材与试剂 主要仪器设备：倒置生物显微镜、数显低温温度计、恒温操作台、恒温水浴锅、恒温培养箱、液氮容器、假阴道及集精杯。

主要试剂药品：葡萄糖、乳糖、柠檬酸钠、青霉素、链霉素、75%酒精、医用凡士林、新洁尔灭和高锰酸钾。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物的准备 选择身体健康、性欲旺盛的公羊，提前1～2月加强运动，提高日粮中维生素和蛋白质水平，提前2～3周训练采精并检查精液质量。采精前刷拭羊体，尤其是待采精公羊腹部和台羊后躯，用消毒液冲洗公羊包皮。

1.2.2 器材的准备 所有器材提前一天洗刷、晾干，提前半天消毒备用。采精前将假阴道与集精杯装好，假阴道内前1/3部分涂以灭菌医用凡士林，用生理盐水冲洗内胎，自注水孔装入适量37～45℃温水，打气，用灭菌纱布包住两端，置于恒温箱中备用。

1.2.3 溶液的配制 基础液：100mL水+3.4gTriss+1.9g柠檬酸+0.55 g葡萄糖。I液：8.2 mL基础液+1.8 mL卵黄。II液：9.4 mL I液+0.6 mL甘油。Ringer液：0.85%氯化钠+0.033%氯化钙+0.03%氯化钾+0.2%葡萄糖。

1.2.4 采精与精液品质检查

（1）以发情母羊作台羊（训练有素的公羊也可以用公羊作台羊）。将公羊刷拭，然后牵入采精室准备采精。正式采精前让其空爬几次，以提高采精量与精子质量。常规采精。

（2）取下集精杯置于32℃水浴中，记录精液颜色、气味、云雾状及采精量。颜色、气味异常的精液不要。

（3）精子密度估算。取一小滴精液于洁净载玻片上，加盖盖玻片，显微镜下400～600倍观察。视野中精子间空隙很小，看不清单个精子的运动，记为密，精子数在10亿以上/mL；间隙明显，彼此间距离约为一个精子长度，有些精子的活动可以清楚的看到，记为中，精子数在2～10亿；精子分散存在，间隙超过一个精子的长度，记为稀，精子数在2亿以下。

（4）活力估测。滴一滴稀释精液于载玻片上，250～400倍镜下观察，直线运动精子数在总精子数中所占的比率即为活力。

（5）准确精子计数。原精液用3%盐水稀释，于血球计数板上镜下数精子数，按公式求得精子密度。

1.2.5 精液处理

（1）离心去精清。取精液于离心管中，加入5～10倍体积的稀释液，轻轻混匀，配平，置于离心机中离心，离心结束后弃去上清。重复1～2次。

（2）稀释与降温。用配好的稀释液按比例稀释，用纱布包裹后置于冰箱中约2 h降至4℃，用Ⅱ液按比例稀释，装管，平衡30 min。

（3）冷冻。在泡沫盒里加入1/3以上的液氮，铝饭盒漂浮其上（饭盒表面温度约-130℃），将平衡好的细管置于饭盒管上，约5 min后完全浸入液氮中。

（4）解冻检查。随机挑选2～3支精液于37℃温水中解冻，剪去细管头，滴少量精液于载玻片上，镜检精子活力。

1.3 统计分析

所有数据以“平均数±标准差”表示，用SPSS12.0软件进行差异显著性分析。

2 试验结果

2.1 几种洗涤液对精子活力的影响

分别以生理盐水、稀释液基础液和Ringer液作为洗涤液，按上述方法处理精液，完成冷冻并检查解冻后的精子活力。离心采用1 000 r/min，8 min。

表1 在不同洗涤液液组的精子活力

2.2 离心转速对离心效果及精子活力的影响

用基础液作洗涤液，分别采用500 r/min、1 000 r/min、1 500 r/min、2 000 r/min，离心 10 min，按上述的方法处理精液，比较试验结果。

表2 在不同离心转速下的精子活力变化

2.3 离心时间对离心效果及精子活力的影响

用基础液作洗涤液，采用1 000 r/min，分别离心5 min、10 min、15 min、20 min，按上述的方法处理精液，比较试验结果。

表3 不同离心时间的精子活力变化

2.4 洗涤次数对精子活力的影响

以基础液作洗涤液，采用1 000 r/min，10 min离心，分别洗涤1次、2次、3次、4次，按上述的方法处理精液，比较试验结果。

表4 不同洗涤次数对精子活力的影响

3 讨论

精清成分非常适合精子生存，对精子起营养和支持作用。但有研究认为精浆中同时存在着许多尚未被人类所了解清楚的蛋白质成分。在多种动物的精浆中已发现许多抗生育因子，如去能因子、人类抗生育因子、兔顶体稳定因子、牛精浆素和山羊卵黄凝结酶等，这些因素通过抑制精子的获能、顶体反应的发生、诱导顶体酶的提前释放等机制影响精子活力[4]。多数研究认为山羊精液冷冻保存需要进行去精清处理[1，4，6]，主要是精清中的磷脂酶或类磷脂酶等物质对精子，尤其对冷冻后精子的品质十分不利。目前关于崂山奶山羊精液冷冻保存的研究还没有报道，本研究通过去精清处理过程中几个方案的比较，获得了一套精液保存效果理想的处理方案。

通过几种洗涤液的比较研究发现，使用稀释液的基础液组效果最好，Ringer液组效果最差，差异显著。分析原因认为，这种方案对液体成分改变最小，不会在洗涤、稀释等程序中多次改变液体成分，使精子一直在相对稳定的液体环境中，免受反复冲击，有利于精子活力的保持。

而在离心时间和转速的研究中发现，最佳的组合是1 000 r/min，离心10 min，速度过低或时间过短不能使精子与精清分离，达不到离心的目的；速度过高或时间过长虽然离心彻底，但是会使精子因相互挤压而造成损伤，影响精子活力。离心时间超过20 min，转速超过2 000 r/min，会对精子活力造成较大影响，与最佳组合相比差异显著。

在洗涤次数的比较中发现，随着洗涤次数的增加精子活力不断下降，离心和反复稀释都会对精子造成伤害，但相邻的两组之间没有显著差异；而离心1次的解冻活力不如2次好，分析结果应还与每一次的稀释倍数有关，在高倍稀释的情况下一次离心可能也会达到较好的效果。在本研究中采用2次洗涤，每次5倍稀释效果最好。

去精清处理一方面要尽量去除干净，另一方面要尽量减少对精子造成的损伤，保持精子活力。通过几个对比试验发现，在尽可能大倍数稀释的情况下选择适当的离心转速和时间非常重要，液体成分也不要反复改变，这样有利于精子活力的保持。在本研究中采用稀释液的基础液做洗涤液，1 000 r/min，离心2次，每次10 min，效果最好，解冻活力达0.55，是一套成功的方案。

[1] 张建军，史兆国，杨军祥，等.波尔山羊除精浆冷冻精液的试验研究[J].中国草食动物，2008，28（1）:25，26.

[2] 杨素芳，邹知明，黎江山，等.山羊精液冷冻保存技术研究[J].安徽农业科学，2008，36（11）：4532-4533，453.

[3] 徐振军，赵冰，魏丹，等.绒山羊精液冷冻保存技术的研究[J].中国畜牧杂志，2009，45（1）:16-18.

[4] 杨军祥.除去精浆对波尔山羊冷冻精液品质的影响[J].中国草食动物，2009，29（2）:22-24.

[5] 刘兴伟，李静，宋先忱，等.精液处理方法对辽宁绒山羊冻精质量的影响[J].黑龙江动物繁殖，2007，15:39，40.