HPLC同时测定制草乌中三种生物碱质量比

张智圆,沈志滨,季宇彬

制草乌为毛茛科植物北乌头(Aconitum kusnezoffiiReichb).干燥块根的炮制加工品[1],主要含有新乌头碱、次乌头碱和乌头碱等生物碱类成分[2].文献多见对其中两种生物碱及总生物碱进行测定[3-6],同时对3种生物碱质量分数进行测定的文献报道罕见.本文同时测定6个不同地区制草乌中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的质量分数,为制草乌生产规范化、饮片生产标准化提供质量控制依据.

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(Waters 515,2487 UV检测器,EmPower色谱工作站);对照品购于中国药品生物制品检定所,乌头碱(批号:110720-200410),次乌头碱(批号:0798-9403),新乌头碱(批号:0799-9403).

制草乌饮片由广东药学院生药教研室李书渊副教授鉴定为毛茛科植物北乌头(Aconitum kusnezoffiiReichb).干燥块根的炮制加工品.产地及编号见表1.

表1 制草乌产地

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水-氯仿-三乙胺(w/w 70∶30∶2∶0.1),流速为1.0mL/min,检测波长为230 nm,柱温为室温[7].

2.2 溶液制备及色谱检测

2.2.1 对照品溶液的制备及色谱检测

分别精密称取新乌头碱、次乌头碱及乌头碱,二氯甲烷配制成1.00、1.00、0.39mg/mL对照品溶液.精密吸取1 mL,置于10 mL离心管中,精密加入0.01m L H2SO41mL,涡旋2 min,离心5 min(3 000 r/min),取水层20μL进样.色谱图见图1.

图1 对照品HPLC色谱图

2.2.2 供试品溶液配制及色谱检测

精密称定制草乌粗粉10 g,氨试液4 mL润湿,乙醚50mL浸泡14 h,过滤.乙醚洗涤药渣15m L×3次,合并乙醚液,60℃以下蒸干,二氯甲烷溶解并定量转移残渣至5mL容量瓶,精密吸取1m L,置于10 mL离心管中,精密加入0.01 m L H2SO41m L,涡旋2 min,离心5 min(3 000 r/min),取水层20μL进样[8].色谱图见图2.

图2 供试品HPLC色谱图

2.3 实验结果

2.3.1 线性关系考察

分别精密吸取标准品溶液0.25、0.5、1、2、3 m L,至10 mL尖底具塞试管中,精密加入0.01 mol/LH2SO41m L,涡旋2min,3 000 r/min,离心5 min,取水层20μL进样,按上述色谱条件测定峰面积,以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,求得相应回归方程,见表2.

表2 标准曲线与线性范围

2.3.2 稳定性实验

取舟山A制草乌粗粉,按2.4.2.2方法制备供试品溶液,于0、2、4、6、8 h分别测定其相应生物碱的峰面积.由标准曲线求其质量比,新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的RSD分别为2.3%、2.1%和1.5%.

2.3.3 精密度实验

精密量取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱混合对照品溶液1 mL,按标准曲线及线性范围项下进行分析,平行5份,新乌头碱、次乌头碱和乌头碱峰面积的RSD分别为1.8%、2.5%、2.8%.

2.3.4 重现性试验

取舟山A制草乌粗粉5份[9],按2.4.1.2项下制备供试品溶液,分别测定质量分数,测得新乌头碱、次乌头碱和乌头碱RSD分别为2.9%、3.7%和1.3%.

2.3.5 加样回收率试验

精密称取舟山A制草乌粗粉,加入一定量的对照品,依上述色谱条件测定峰面积,计算三者的加样回收率分别为96.1%、95.8%和95.3%.其RSD分别为1.8%、1.3%和2.0%.

2.3.6 样品质量比测定

分别取不同供试品溶液20μL,按上述色谱条件进样,测得供试品中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱相应峰面积,计算质量比,结果见表3.

表3 样品中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱质量比

3 结 语

本实验采用HPLC法同时检测6个不同地区中制草乌中三种乌头碱的质量比,得到结果:新乌头碱10～120μg/m L,次乌头碱3.9～46.8μg/m L,乌头碱在10～120μg/mL范围内线性关系良好,平均回收率分别为96.1%、95.8%和95.3%.其酯型生物碱质量分数均不超过0.15%,符合中国药典规定.

[1]《中国药典》2005版[M]I部.VOL.26-27;163-164.

[2]李文兰,王艳萍.中药乌头的实验研究[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2006,22(4):13-17.

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[4]王朝虹,何 毅,张继宗,等.高效液相色谱法测这下草乌中乌头碱含量[J].刑事技术,2003(1):15-16.

[5]孙爱民,陈德华,毕培曦.高效毛细管电泳法测定中草药川乌、草乌中乌头碱的含量[J].色谱,1999,17(1):67-69.

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[7]LI Y P,TIANSJ,WANG G R.Chem ical compounds and analysis methods of aconitum[M].China J Chin Mater Med,2001,26(10):659-661.

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[9]杨书良,吴 亚,杨 波,等.HPLC法测定番泻叶滴丸中番泻苷B的含量[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2009,25(11):11-12.