大孔树脂分离纯化中药复方多糖的工艺研究

李赞阳，刘红，李炳奇，孙萍，谷新利

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2石河子大学化学化工学院，石河子832003）

大孔树脂分离纯化中药复方多糖的工艺研究

李赞阳1，刘红2，李炳奇2，孙萍2，谷新利1

（1石河子大学动物科技学院，石河子832003；2石河子大学化学化工学院，石河子832003）

对AB－8型大孔树脂分离纯化中药复方免疫增强剂中多糖的工艺条件进行研究，采用苯酚－硫酸法测定大孔树脂对分离纯化多糖的吸附率、解吸率及影响因素。结果显示：最佳工艺条件为上样液药复方多糖的浓度为5．93 mg／mL、速率2BV／h、体积2BV，洗脱液乙醇的体积浓度为50%、速率3BV／h、用量3BV。AB－8型大孔树脂的吸附率、解吸率分别达到71．0%、93．1%，所得多糖含量为79．8%，表明AB－8型大孔树脂对中药复方多糖有较好的分离纯化性能。

AB－8型大孔树脂；分离纯化；多糖；中药复方多糖

目前，畜牧业生产中抗生素类药物的滥用，不但导致了致病菌耐药性和变异菌株的出现，还造成了畜禽体内的药物残留。畜禽机体免疫力的提高，有助其可提高机体抗病力。目前，对中药多糖免疫增强作用的研究已成为预防畜禽疾病研究中一个热点领域［1－9］。

中药的多糖（Polysaccharides）具有广泛的免疫调节、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、调节造血等功能及抗氧化等多种生物活性［1－2］。谷新利等［9］证实中药方剂中提取的复合多糖能增强雏鸡免疫效果。徐小芳等［10］对中药复方多糖、黄芪多糖、当归多糖、淫洋藿多糖对鸡抗氧化功能的影响进行对比研究，发现中药复方多糖抗氧化能力最强。

毛讯［11］对大孔树脂AB－8纯化麦冬多糖的工艺进行了研究，得到了最佳工艺条件，使麦冬多糖纯度可达到81．0%。郭代英等［12］筛选纯化无花果多糖的最佳大孔树脂及最佳工艺条件。但目前，还未见有关中药复方多糖纯化工艺的报道。因此，本研究在谷新利等［9］研究的中药复方多糖的配方基础上，应用分离纯化技术对中药复方免疫增强剂中多糖进行分离纯化，旨在为进一步探索中药复方多糖对机体作用机理提供参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 药品与试剂

中药复方免疫增强剂（由本实验室保存）；AB－8大孔树脂（天津市南开和成科技有限公司），其它试剂均为分析纯。

1．1．2 仪器

722N型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；BS423S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；RE－52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TDL－5台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；电热恒温干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）；真空 ALPHR1－2LD冷冻干燥机（德国Christ公司）。

1．2 方法

1．2．1 大孔吸附树脂的预处理

取AB－8大孔吸附树脂，用95%乙醇浸泡24h，然后湿法装柱；用95%乙醇冲洗层析（流速2BV／h，BV为树脂体积数，下同），至流出液加2倍蒸馏水后不产生浑浊为止，再用大量蒸馏水洗至流出液澄清；继续用2～3BV的5%盐酸溶液洗层析柱（流速4～6BV／h），并浸泡2～3h，再用蒸馏水以同样的流速洗至中性；用2～3BV的5%氢氧化钠溶液洗层析柱（流速4～6BV／h），浸泡2～3h后，再用蒸馏水以同样的流速洗至pH 7．0。用95%乙醇浸泡备用。

1．2．2 中药复方多糖上样液的制备

将中草药复方粉碎过一定目筛，称取中药复方粉末经石油醚，乙醇浸提抽滤。滤渣中加数倍体积蒸馏水，浸提数小时，提取3次，抽滤合并滤液，减压浓缩。向浓缩液中加无水乙醇，使其浓度达80%，冰箱中4℃过夜。然后氯仿－正丁醇除蛋白4次［13］。沉淀依次用乙醚、丙酮、无水乙醇多次洗涤，放入烘箱中于50℃干燥，得中药复方多糖。

精密称取干燥的中药复方多糖加蒸馏水溶解后，配成所需的上样液浓度。

1．2．3 中药复方多糖的含量测定方法

以葡萄糖为对照品，用紫外可见分光光度法在490nm测定。线性回归方程为：

1．2．4 多糖吸附率及解吸率的计算

将中药复方多糖一定浓度样品液通过层析柱，进行动态吸附。然后用不同浓度乙醇溶液进行洗脱。动态吸附率和动态解吸率的计算公式分别为：

式（2）、（3）中：DX为动态吸附率，%；DJ为动态解吸率，%；C0为吸附前溶液中多糖浓度，mg／mL；C1为吸附后样液中多糖的浓度，mg／mL；C2为解吸溶液中多糖的浓度，mg／mL；V 为上样液体积，mL；V1为解吸溶液体积，mL。

1．2．5 动态吸附与解吸条件的优化

取20g预处理过的AB－8大孔树脂于玻璃柱中，按照以下条件上样及洗脱，并测定多糖含量，计算其吸附率及解吸率。

对影响大孔树脂的吸附效果的上样液速率、样液浓度、样液体积3个因素，每个因素选择5个水平，选择单因素进行方案设计，根据单因素试验将上样液速率、样液浓度、样液体积作为动态吸附考察指标，试验设计见表1。

表1 大孔树脂吸附单因素水平设计Tab．1The experimental design of level of single factor of macroporous resin adsorption

对影响大孔树脂的解吸效果的洗脱（洗脱剂为乙醇）速率、洗脱体积分数、洗脱剂用量3个因素，每个因素选择5个水平，选择单因素进行方案设计，将洗脱速率、洗脱体积分数、洗脱剂用量作为动态解吸考察指标，试验设计见表2。

表2 大孔树脂解吸单因素水平设计Tab．2The experimental design of level of single factor of macroporous resin desorption

1．2．6 验证试验

按照大孔树脂吸附和解吸中药复方多糖的最佳条件进行试验，将洗脱残液减压浓缩，向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇低温静置过夜。抽滤，将所得多糖放入真空冷冻干燥机干燥。用苯酚－硫酸法测多糖含量。

2 结果与分析

2．1 大孔树脂的吸附效果

2．1．1 上样液浓度对多糖的动态吸附率的影响

结果见图1。图1表明，当上样液多糖浓度为5．93mg／mL时，大孔树脂对多糖的吸附效果最好，多糖上样浓度偏高或偏低，吸附率均降低。

2．1．2 上样液速率对多糖的动态吸附率的影响

结果见图2。由图2可见，上样液的速率为2 BV／h时，大孔树脂对多糖的吸附效果好，多糖的上样速率超过2BV／h时，其吸附率迅速降低。

2．1．3 上样液体积对多糖的动态吸附率的影响

结果见图3。由图3可见，随着上样液的体积数增大，过柱后的泄露量逐渐增大，超过2BV后泄漏量显著增大，因此上样液的最佳体积数为2BV。

图1 上样液浓度对多糖动态吸附效果的影响Fig．1The effect of the concentration of sample liquid on the dynamic adsorption rate of polysaccharide

图2 上样液流速对多糖动态吸附效果的影响Fig．2The effect of the flow velocity of sample liquid on the dynamic adsorption rate of polysaccharide

图3 上样液体积数对多糖动态吸附效果的影响Fig．3The effect of the sample liquid volume on the dynamic adsorption rate of polysaccharide

2．2 大孔树脂的解吸效果

2．2．1 洗脱剂的浓度对多糖的动态解吸率的影响

洗脱剂乙醇的浓度对多糖的动态解吸率的影响见图4。

由图4可见，随着洗脱剂浓度的增加，树脂对多糖的解吸率逐渐提高，但当洗脱剂浓度超过55%时，多糖产生浑浊，影响了洗脱效果。所以洗脱剂浓度50%时为最佳水平。

2．2．2 洗脱剂的速率对多糖的动态解吸率的影响

洗脱剂的速率对多糖的动态解吸率的影响见图5。

由图5可见，洗脱速率为3BV／h时，对多糖的解吸率最大，所以3BV／h为最佳洗脱速率。

2．2．3 洗脱剂用量对多糖的动态解吸率的影响

洗脱剂用量对多糖的动态解吸率的影响见图6。

由图6可见，洗脱剂用量为3BV时，对多糖的解析率达到最高，之后，随着洗脱剂用量的增加，多糖的解吸率缓慢下降。因此洗脱剂用的最佳量为3 BV。

图5 洗脱剂的速率对多糖的动态解吸率的影响Fig．5The effect of the flow velocity of Elution rate on the dynamic desorption rate of polysaccharide

图6 洗脱剂量对多糖的动态解吸率的影响Fig．6The effect of Elution amount on the dynamic desorption rate of polysaccharide

2．3 验证试验结果

综合上述试验结果，大孔树脂吸附和解析的最佳条件为：上样液中药复方多糖的浓度为5．93mg／mL、速率2BV／h、体积2BV，洗脱乙醇的体积浓度50%、速率3BV／h、用量3BV，大孔树脂的吸附率、解吸率分别达到71．0%、93．1%，所得多糖含量分别为78．6%、79．4%、81．2%、79．7%、90．1%，平均含量为79．8%。

3 讨论

大孔树脂具有吸附能力强、易洗脱、机械强度高、抗污染能力强等优点，但对于上样液浓度、上样液速率、体积量、洗脱液浓度、洗脱流速和洗脱剂用量等因素都会不同程度影响其吸附解吸效果［14］。本实验用AB－8大孔吸附树脂分离纯化中药复方多糖，并对各影响因素进行了全面考察和优化研究，并进行了验证实验以保证纯化效果。

中药复方免疫增强剂中的多糖成分具有免疫调节作用［15］，然而多糖的研究多集中在复方的粗提［15］或单味中药的分离纯化［11］。本试验在李星艳等［15］得出的粗多糖含量为42．82%时具有免疫调节基础上，通过AB－8大孔树脂对中药复方多糖进一步进行提纯，多糖含量达79．8%。这说明采用大孔吸附树脂分离纯化中药复方多糖具有很好的效果，可以作为中药复方多糖的有效富集方法。

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［10］徐小芳，罗燕，赵民，谷新利．中药复方多糖对鸡抗氧化功能的影响［J］．中国农业科学，2009，42（2）：706－713．

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Isolation and Purification Technology of Polysaccharide from Chinese Compound Polysaccharide by Macroporous Resin

LI Zanyang1，LIU Hong2，LI Bingqi2，SUN Ping2，GU Xinli1
（（1College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China；2School of Chemistry and Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

To study the separation and purification conditions of polysaccharide from Chinese compound polysaccharide by macroporous resin AB－8，the adsorption rate，desorption rate and impact factors adopted as indexes were tested by phenol－sulfuric acid method．The result showed that the optimal conditions were determined as follows：Chinese compound polysaccharide in the solution of 5．93mg／mL，the sample flow velocity of 2BV／h，the volume of 2BV，3BV of 50% （volume fraction）ethanol washing at the flow velocity of 3BV／h，the adsorption rate，desorption rate of macroporous resin were 71．0%and 93．1%respectively，and the content of the polysaccharide reached 79．8%．The conclusion is that macroporous resin AB－8displayed the efficient reactivity in separation and purification of Chinese compound polysaccharide．

macroporous resin AB－8；isolation and purification；Chinese compound polysaccharide

S853

A

2010－08－15

国家自然科学基金项目（30960291）

李赞阳（1983－）男，硕士生，研究方向为中草药的开发与利用；e－mail：lizanyang00＠sina．com。

谷新利（1963－）男，教授，博士生导师，从事中草药的开发与利用研究；e－mail：xlgu＠shzu．edu．cn。