新疆蔷薇红景天对小鼠急性肝损伤保护作用的研究

张珂，李国玉，王航宇，娄猛猛，冯文文，谢石安，王金辉，2

（1石河子大学药学院／新疆特种植物药资源重点实验室，石河子832002；2沈阳药科大学中药学院，沈阳110016）

新疆蔷薇红景天对小鼠急性肝损伤保护作用的研究

张珂1，李国玉1，王航宇1，娄猛猛1，冯文文1，谢石安1，王金辉1，2

（1石河子大学药学院／新疆特种植物药资源重点实验室，石河子832002；2沈阳药科大学中药学院，沈阳110016）

为研究新疆蔷薇红景天对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用。采用0．2%四氯化碳橄榄油溶液按10 mL／kg腹腔注射造模，以血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的活性，肝组织中还原性谷胱甘肽（GSH）活性、丙二醛（MDA）含量以及肝组织形态变化为指标，观察新疆蔷薇红景天对肝损伤的保护作用。结果：新疆蔷薇红景天正丁醇萃取物高剂量 （3．0g生药／kg）组显著降低小鼠血清AST、ALT活力（P＜0．05）以及肝组织中 MDA含量（P＜0．05）、显著升高肝组织中GSH活性（P＜0．05）；肝组织变性明显减轻，肝组织结构比较完好。结论：蔷薇红景天对小鼠四氯化碳所致小鼠急性肝损伤有保护作用。

蔷薇红景天；急性肝损伤；CCl4

蔷薇红景天（Rhodiola rosea L．）为景天科（Crassulaceae）红景天属（Rhodiola L．）植物。民间多以全草入药，主要用于清肺止咳、止血、止带的功效［1］，古代亦用作滋补强壮药。研究表明，红景天可明显抑制3T3成纤维细胞增殖［2］；其水煎剂对四氯化碳造成的大鼠急性脂质过氧化肝损伤模型具有明显保护作用，可使大鼠血清ALT、LDH、CPK以及血浆SOD、血清IPO明显降低［3－4］；红景天能阻抑肝细胞内脂褐素的形成，降低酸性磷酸酶活性，抑制大鼠肝细胞脂质过氧化，增强血清过氧化物歧化酶活性［5］；红景天苷对实验性肝损伤小鼠具有较好的保护作用［6－7］。

本实验旨在研究新疆蔷薇红景天对肝细胞的保护作用，发现其有效部位，为该药的临床应用提供可靠的理论依据。

1 仪器与材料

1．1 试剂与仪器

试剂：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、丙二醛、还原性谷胱甘肽试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号 分 别 为 20090928、20090928、20091217、20091217；复方益肝灵片吉林省博维药业有限公司生产，成分为水飞蓟和五味子，每片含水飞蓟素以水飞蓟宾计为21mg，批号：20081201。其余试剂均为分析纯。

仪器：Shimadzu UV－2401紫外可见分光光度计（日本岛津公司），TG16－WS高速离心机，（南赛特仪器厂）；Sartorius BS210S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），SK5200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）等。

1．2 动物

昆明种雄性小鼠72只，体重（20±2）g，由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（新）2003－0001。智能型触摸屏独立送回风净化笼IVC饲养（苏州市苏杭科技器材有限公司），自由摄食饮水，饲养环境温度控制在（25±1）℃，相对湿度（50±5）%，换风次数为每小时27次，安静，12h光照周期。

1．3 实验药物

新疆石河子市市售的新疆蔷薇红景天（Rhodiola rosea L．）的干燥根茎，由新疆石河子大学药学院谭勇博士鉴定。标本号为No．20071003001，保存在石河子大学药学院。

蔷薇红景天根茎粉碎，以95%乙醇（10、8、8倍量）回流提取3次，每次3h，合并提取液，减压浓缩成浸膏，浸膏用适量的水分散成混悬液将浓缩后提取物用适量水稀释，依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇萃取物临用前以生理盐水混悬，配制成相应浓度。

1．4 实验方法

1．4．1 动物分组及给药

小鼠CCl4急性肝损伤模型的建立［8］：昆明种雄性小鼠72只随机分成6组，正常对照组、阳性对照组、模型组、新疆蔷薇红景天正丁醇萃取物（RRB）低、中、高剂量给药组分别按生药量3．0，1．0，0．3g／kg灌胃新疆蔷薇红景天正丁醇萃取物，阳性对照组按水飞蓟素0．2g／kg灌胃益肝灵混悬液，正常对照组和模型组等体积灌胃生理盐水，1次／d，连续7d，给药容积为0．2mL／20g；第6d，模型组、阳性对照组及给药组按10mL／kg腹腔注射0．2%CCl4橄榄油溶液，正常对照组腹腔注射等体积橄榄油，末次给药1h后除正常组以外，各组小鼠按文献［9］中的方法ip 0．2%的CCl4橄榄油溶液10mL／kg，禁食不禁水；24h后眼静脉采血，常规离心后分离血清测定ALT和AST活力。

引颈处死后迅速解剖，摘取小鼠肝脏，按试剂盒要求制备肝匀浆。从相同部位取肝组织，固定在10%的甲醛溶液中待测。

1．4．2 生化指标测定

按试剂盒说明测定小鼠血清AST、ALT活性，肝匀浆中GSH活性、MDA含量，用Shimadzu UV－2401紫外－可见分光光度计比色法测定。

1．4．3 病理观察

将10%福尔马林所固定的肝组织石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察其病变。

1．4．4 统计学处理

实验数据均以¯χ±S表示，所有实验数据均采用单因素方差分析。

实验数据处理所用分析软件均为SPSS13．0，P＜0．05认为具有统计学意义。

2 实验结果

2．1 对血清AST、ALT活性的影响

结果见表1。

由表1可知：与正常组相比，模型组小鼠血清AST、ALT活力明显升高，存在显著性差异（P＜0．05），表明实验造模成功；与阳性药益肝灵相比，新疆蔷薇红景天高剂量可使升高的血清AST、ALT活力值下降。

表1 RRB对急性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响S，n＝12 Tab．1Effect of RRB on the activities of serum ALT and AST in mice

表1 RRB对急性肝损伤小鼠血清ALT和AST的影响S，n＝12 Tab．1Effect of RRB on the activities of serum ALT and AST in mice

注：与模型组比较，＊表示P＜0．05；与正常组比较，＃＃表示P＜0．01。

组别 剂量／（g／kg） ALT／（U／L） AST／（U／L）51．49±12．45 42．07±8．45模型组 — 331．51±59．91＃＃322．95±26．94＃＃益肝灵 0．2 162．11±42．7＊ 94．96±14．23＊RRBⅠ 0．3 290．80±67．91 311．19±63．26 RRBⅡ 1．0 234．27±27．77 299．98±39．41 RRBⅢ 3．0 173．12±35．20＊ 182．39±19．67正常组 —＊

2．2 对肝组织中GSH活性、MDA含量的影响

结果见表2。

表2显示：与正常组相比，模型组肝组织GSH活性明显降低、MDA含量明显升高（P＜0．01）表明本实验造模成功；与模型组相比，新疆蔷薇红景天高可显著降低肝组织中 MDA含量（P＜0．05），并能使降低的肝组织GSH活性升高。

表2 RRB对急性肝损伤小鼠肝组织GSH和MDA的影响，n＝12Tab．2Effect of RRB on the activities of liver GSH and MDA in mice

表2 RRB对急性肝损伤小鼠肝组织GSH和MDA的影响，n＝12Tab．2Effect of RRB on the activities of liver GSH and MDA in mice

注：与模型组比较，＊表示P＜0．05；与正常组比较，＃表示P＜0．05。

组别 剂量／（g／kg） GSH／（mg／g） MDA／（nmol／mg）2．20±0．43 0．59±0．15模型组 — 1．70±0．08＃ 1．24±0．32＃益肝灵 0．2 1．90±0．59＊ 0．63±0．18＊RRBⅠ 0．3 1．35±0．16 1．18±0．25 RRBⅡ 1．0 2．11±0．34＊ 1．01±0．16 RRBⅢ 3．0 3．46±0．53＊ 0．88±0．15正常组 —＊

2．3 对肝组织病理变化的影响

由图1可见：HE染色，在光镜下发现正常对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，结构正常、清晰。CCl4模型组小鼠肝窦及中央静脉明显扩张，肝细胞广泛坏死，细胞膜不清楚，胞浆液连成一片，病灶区周围肝细胞发生不同程度的气球样变及嗜酸性变，有大量炎性细胞浸润，新疆蔷薇红景天高剂量组肝细胞变性、坏死、炎症反应明显减轻。新疆蔷薇红景天中剂量组和低剂量组肝细胞肿胀变性、坏死和炎症反应较四氯化碳组有所改善。

图1 RRB对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响Fig．1Effect of RRB on CCl4－induced hepatotoxicity in mice

3 讨论

目前，肝病仍是一种发病率较大而且难以根治的疾病，各种病因以及有毒物质所致的肝损伤均可引起细胞凋亡，并继发肝纤维化的病理过程。大量研究表明，在肝细胞病变过程中，自由基、酶以及脂质过氧化等均发挥重要作用。在正常情况下，生物体内活性氧自由基的产生和清除维持在一定水平，过多或过少均会给机体造成损害［10］。四氯化碳（CCl4）诱导的化学性肝损伤动物模型被广泛应用于肝细胞保护药物的研发中［11－12］。CCl4是一种毒性很强的化学物质，进入机体后，在体内经肝细胞微粒体内细胞色素P450代谢成三氯甲基自由基和氯自由基，导致肝微粒体的脂质过氧化，并在其启动的过氧化连锁反应中，产生毒性作用更强的二氯甲基自由基及过氧化甲基自由基，自由基产生后会攻击细胞膜和膜样物质如线粒体和内质网；CCl4同时能抑制内源性抗氧化酶（如SOD）活性，致使大量自由基无法清除，加重脂质过氧化，导致钙内环境稳态的紊乱，最后引起细胞凋亡［13－14］，损伤肝细胞膜的结构和功能，导致存在于肝细胞质中的可溶性酶AST和ALT释放入血，因此血清中AST和ALT水平的高低可作为反映肝细胞受损的敏感性指标。GHS是细胞内主要的抗氧化酶类，可清除体内过多的自由基，激活或调动集体中的内源性抗氧化系统，预防或减轻自由基损伤；MDA是脂质过氧化反应过程中不饱和脂肪酸氧化分解释放出来的反应性醛，是脂质过氧化的主要降解产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀坏死，因此GSH和MDA的含量的高低可间接反映肝细胞氧化损伤的程度。

本研究结果表明，对预先给予蔷薇红景天正丁醇萃取物，能显著降低CCl4引起的急性肝损伤后血清中AST和ALT得水平，同时还明显降低肝组织MDA的含量以及升高肝组织GSH的含量。这些结果显示，蔷薇红景天对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用，可能与增强机体酶的活力，清除自由基抑制脂质过氧化反应，降低脂质过氧化主要产物MDA的产生，提高肝细胞抗氧化能力，从而拮抗CCl4所引起的膜脂质过氧化损伤，促进肝细胞的再生和修复有关。同时肝组织病理结果也验证了这点。

保肝药物的作用的主要机制是通过其抗氧化作用来清除活性氧自由基［15－16］，而蔷薇红景天中富含苯乙醇苷类、苯丙烯醇苷类、黄酮及黄酮苷类和多酚类等具有较强的抗氧化能力，可清除自由基，这些物质对活性氧自由基、超氧自由基、超氧阴离子自由基均有明显的清除作用，但对于蔷薇红景天对CCl4所制小鼠急性肝损伤的作用机制有待做更深入的研究。

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Protective Effect of Rhodiola Rosea L．on Liver Injury Induced
by Carbon Tetrachloride in Mice

ZHANG Ke1，LI Guoyu1，WANG Hangyu1，LOU Mengmeng1，FENG Wenwen1，XIE Shian1，WANG Jinhui1，2
（1School of Pharmacy，Shihezi University／Key Laboratory of Phytomedicine Resources ＆ Modernization of TCM，Shihezi 832002，China；2School of Traditional Chinese Materica Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

To study the protective effect of Rhodiola rosea L．against acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice，the animal model of acute liver injury was established by intraperitoneal injection of 0．2%carbon tetrachloride olive oil 10mL／kg．Alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）in serum and malondialdehyde（MDA），reduced glutathione hormone（GSH）in liver homogenate were assayed．The histopathological changes of the liver were assayed．The result showed that the nbutanol extract of Rhodiola rosea L．at an oral dose of 3．0g／kg／day showed a significant hepatoprotective effect relative to the same extent（P＜0．05）by reducing levels of serum aspartate transaminase（AST），alanine transaminase（ALT）and malondialdehyde（MDA）levels，increasing reduced glutathione hormone（GSH）．Degeneration of hepatocytes was obviously prevented in mice treated with Rhodiola rosea L．and the liver histological structure was well maintained．Rhodiola rosea L．has protective effect on acute liver injury induced by carbon tetrachloride in mice．

Rhodiola rosea L．；liver injury；CCl4

R963

A

2010－05－30

国家自然科学基金项目 （30960493），国家重大新药创制项目（2010ZX09401－304）

张珂（1984－），女，硕士生，专业方向为天然药物化学。

王金辉（1972－），男，教授，从事天然药物化学研究；e－mail：wangjh．1972＠vip．sina．com。