1株高产蛋白酶嗜麦芽寡养单胞菌的分离鉴定及其酶学活性的研究

闫志勇,毕春霞,辛晓妮,罗 玮,代玉梅,王 斌

(1.青岛大学医学院微生物学教研室,山东青岛 266071;2.青岛市立医院检验科,山东青岛 266071)

1株高产蛋白酶嗜麦芽寡养单胞菌的分离鉴定及其酶学活性的研究

闫志勇1,毕春霞2,辛晓妮1,罗 玮1,代玉梅1,王 斌1

(1.青岛大学医学院微生物学教研室,山东青岛 266071;2.青岛市立医院检验科,山东青岛 266071)

双齿围沙蚕消化道中分离 1株高产蛋白酶菌株 D2(CG MCC保藏号:1868),经形态学、生理学、16S rRNA基因序列测定及系统发育分析确定为嗜麦芽寡养单胞菌。Lowry法检测显示该菌株产酶能力为1 104 U/mL,最佳产酶条件为 pH 8.0、25℃培养 48 h;酪蛋白酶图谱法和凝胶成像分析证实其蛋白酶分子量约为 42 ku,在培养上清液中纯度大于 97%;该酶对粗酶品比活性为 301 U/mg,酶活性的最适 pH值为 9,是一种碱性蛋白酶;最适温度为 60℃;在 55℃以下及 pH 6～10的环境中具有较好的稳定性。嗜麦芽寡养单胞菌D2株有望成为一种新的蛋白酶生产资源。

嗜麦芽寡养单胞菌;鉴定;蛋白酶;活性

蛋白酶是一类能水解蛋白质肽链的催化酶,已广泛应用于食品、酿造、饲料、医药、纺织、日用化学等多个领域,是目前世界上产销量最大的商业酶[122]。该酶广泛分布于动物、植物及微生物中。20世纪 90年代以来随着发酵技术的发展,微生物已日益成为工业酶制剂的主要来源,而海洋微生物由于其生存的特殊环境,分泌的各种酶类往往具有诸如作用pH和温度范围广、活性相对稳定等特性,已成为新型生物酶开发的主要资源[324]。近年来我国蛋白酶研究取得了较大进展,但还存在如产酶微生物资源开发不足,蛋白酶种类单一等诸多问题,因此研究的重点仍在于新品种的筛选。本文从海洋生物双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis Grube)消化道中分离出 1株嗜麦芽寡养单胞菌 (Stenotrophom onas m altophilia),可大量分泌某碱性蛋白酶,且在培养液中具有较高浓度和纯度,利于分离纯化和大规模生产;此外,该酶还具有较宽的活性温度和 pH范围。菌株D2已被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏 (保藏号 CG MCC 1868),并有望成为 1株新的具有研究开发潜力的蛋白酶生产菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 双齿围沙蚕采集自青岛胶洲湾近海海岸的泥沙中。将活的沙蚕用无菌海水洗净后置于无菌海水中 24 h使其排净肠道中的代谢物,解剖分离出消化道,用棉拭蘸取内容物接种至营养琼脂平板培养基,25℃培养 24 h,分离单个菌落。

1.1.2 主要试剂 基因组 DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、pGEM2T Easy载体、Folin2酚、酪蛋白等购自 Promega公司;质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.1.3 主要仪器 凝胶成相系统 (UVP GDS8000)、低温高速离心机 (Eppendorf)、冷冻水浴循环仪 (S IM)和真空冷冻干燥仪 (S IM)等。

1.2 方法

1.2.1 产胞外蛋白酶菌株的初步筛选 将从沙蚕消化道分离出的 9株细菌点种于脱脂奶粉平板,25℃孵育 48 h后观察菌落周围溶圈直径。

1.2.2 菌株的形态和生理学鉴定 将筛选出的高产蛋白酶菌株 D2进行革兰染色、透射电子显微镜观察形态。生长温度、NaCl及 pH耐受性、碳源利用及其他生化实验参照文献[5]进行。

1.2.3 菌株的 16S rRNA基因序列测定和系统发育分析 将菌株接种于 LB培养基中培养至对数生长期,基因组 DNA提取试剂盒 (Promega)提取DNA。设计 16S rRNA基因扩增引物,正向引物为5′2AGAGTTTGATCCTGGCTCAG23′,反 向 引 物 为5′2AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA23′,分别对应于大肠埃希菌 16S rRNA基因 (GenBank J01695)的第 8～27位和第 1 519～1 541位核苷酸,由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系 (50μL):模板 2.0μL,TaqDNA聚合酶 0.5 μL,10×PCR缓冲液 5μL,MgCl2(25 mmol/L)5.0μL,dNTP(2.5 mmol/L each)5.0μL,引物(10μmol/L)各 2.0μL;扩增条件:94℃ 6 min后,94℃45 s,54℃45 s,72℃90 s,30个循环后72℃延伸 10 min。将 PCR纯化产物连接到pGEM2T Easy载体上,转化 E.coliJM109,提取质粒后,AB 3730自动测序仪测序。将菌株获得的D2 16S rRNA基因序列与 GenBank已收录的细菌基因序列进行比较;利用 CLUSTAL X(1.83)与其他相关细菌序列进行对比,选用 MEGA(3.0)软件 Kimura 22parameter距离模型进行 NJ分析生成系统发育树,发育树用 Bootstrap法 (重复数为1 000)检验。

1.2.4 菌株 D2培养液中蛋白酶活性成分的确定 将菌株接种到牛肉膏培养基 (0.3%牛肉膏,1.0%蛋白胨,0.5%NaCl,pH 7.2)中 25℃振荡培养 24 h,13 000 r/min 4℃离心 15 min,取上清用滤菌器 (0.20μm)除菌后进行 SDS2PAGE电泳,观察培养液中的蛋白成分,并用 UVP凝胶成像系统对蛋白进行分子量和纯度分析,并采用酪蛋白酶图谱法[6]确定具有蛋白酶活性的组分:将样品加等体积非还原性载样缓冲液混合,取 30 μL加样于含 0.8%酪蛋白的 SDS2聚丙稀酰胺凝胶 (15%),电泳后将凝胶用蒸馏水冲洗干净,浸入复性缓冲液振荡作用 30 min,换液后重复 3次,加入孵育缓冲液 25℃过夜,考玛斯亮蓝 R2250染色液染色,脱色后观察。

1.2.5 菌株 D2产蛋白酶条件的检测 分别测定菌株 D2在不同培养时间、不同培养温度及不同起始 pH值培养基等条件下菌液上清中蛋白酶活性,以确定其产蛋白酶的最佳条件。蛋白酶活性测定采用改良 Folin2酚法[7],酶活力单位为 40℃条件下每分钟水解酪素产生相当于 1μg酪氨酸所需的酶量。

1.2.6 D2蛋白酶性质的初步检测 取菌株 D2培养液少许离心,滤菌后测定上清的蛋白酶活力 (U/mL);其余培养液真空冷冻干燥,蒸馏水溶解后过滤除菌,过夜透析,透析液再次冷冻干燥获得蛋白酶粗提物,称重。用不同 pH缓冲液定量稀释,40℃下测定酶活性的 pH值曲线。在确定的最适酶活性 pH值条件下测定其温度曲线和比活性(U/mg)。

2 结 果

2.1 菌株 D2的生物学特征

革兰染色和透射电镜观察显示,菌株 D2为革兰阴性菌,多数为杆状,两端钝圆,大小约为0.5～1.0μm ×2～4μm,不规则散在排列,菌体的一端有 1～4根鞭毛 (图1)。菌株 D2为专性需氧菌,亚胺培南耐药,触酶、麦芽糖分解、明胶液化、β2半乳糖苷酶试验阳性,氧化酶、靛基质、脲酶阴性,不分解葡萄糖、甘露醇等产酸,上述结果与嗜麦寡养单胞菌的主要特性一致。此外,该菌株的最适生长温度、pH值和 NaCl浓度分别为 28℃、8.5和 1.0%。

2.2 菌株D2的 16S rRNA基因序列和系统发育分析

菌株D 2的16 S rRNA基因序列长为1539 bp,序列见 GenBank DQ839619。与该基因序列一致性 (identity)最高的为嗜麦寡养单胞菌,为99%;同时,系统发育分析显示,菌株 D2与其他嗜麦寡养单胞菌位于同一分支 (图2)。结合 2.1结果,确定该菌为嗜麦寡养单胞菌,菌株已被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号 CG MCC No.1868。

图1 电镜下的菌株 D2Fig.1 Trans mission electron micrograph of strain D2

图2 D2及相关菌株的 16S rRNA系统发育分析Fig.2 Phylogenetic tree of strain D2 and related strains based on 16S rRNA gene sequences

2.3 菌株 D2培养液中蛋白酶活性成分的分离与确定

将菌株 D2培养液上清 SDS2PAGE电泳后发现,只有 1条纯度较高蛋白带;凝胶成像系统分析显示,其大小约为 42 ku,纯度 >97%(图3 A)。酪素酶谱结果显示,在同样大小的位置,底物被消化形成一明显的透明带 (图3 B),表明该蛋白带具有显著蛋白酶活性。

2.4 D2蛋白酶的活性检测及作用特点

菌株D2培养上清液中蛋白酶活力为 (1 104 U/mL),其粗酶品的蛋白酶比活性为 301 U/mg。D2蛋白酶在 pH 7～10范围内酶活性均维持在最大酶活性的 65%以上;其最适 pH为 9,故是一种碱性蛋白酶 (图4)。该酶的最适温度为 60℃,在10～90℃范围内均具有一定活性 (图5)。

2.5 菌株D2的产蛋白酶的条件

菌株D2在培养 48 h后酶活力达到最高,产酶的最佳起始 pH值和培养温度分别为 8.0和25℃。

图3 菌株 D2培养液上清的SDS2PAGE电泳(A)及酪素酶谱分析(B)Fig.3 SDS2PAGE ofD2 fermental supernatant(A)and Casin2Zymogram of proteinase(B)1:菌株 D2的培养液上清;2:空白培养基;M:低分子量蛋白Marker

3 讨 论

图4 D2蛋白酶活性的 pH值曲线Fig.4 Effect of pH on protease activity

图5 D2蛋白酶活性的温度曲线Fig.5 Effect of temperature on protease activity

目前某国内外的蛋白酶生产菌株多是从土壤、温泉水等样本中筛选出的。由于所处的独特环境,从海洋或海洋生物中分离出的嗜热 /冷、嗜盐、嗜酸 /碱、高压等的微生物已成为新型生物学活性酶开发的主要资源。目前已报道的海洋产蛋白酶菌株包括假单胞菌、副溶血弧菌和黄杆菌等[4]。

双齿围沙蚕生活在海边潮间带,由于其主要以废水里的有机物为食被称为“泥滩的清洁工”,因此推测其体内可能具有多种生物活性物质或微生态菌群以助其抵抗外界污染环境的损害。近几年研究人员陆续从沙蚕体内分离出多种生物活性物质[8],本文从其消化道中分离出产蛋白酶菌 D2株,经鉴定证实为嗜麦芽窄食单胞菌。嗜麦芽窄食单胞菌分布广泛,具有很强的代谢活性及广泛的适应能力,是医院感染的植物致病的常见菌。自上世纪 90年代末开始,研究人员陆续从不同来源的该菌中分别分离出蛋白酶、脂肪酶、纤溶酶、核苷酸氧化酶、L2多巴等各种生物活性蛋白[9210],其中相当一部分产物因具有不同的生物学活性,而具有很大的应用潜力和开发价值。

D2蛋白酶比活性为 301 U/mg,与报道的多数其他蛋白酶相当,但 D2株具有较高产酶能力,未经诱变的原始菌在液体培养基中能分泌大量的胞外蛋白酶,上清液中酶的活性达 1 104 U/mL,未经浓缩的培养液直接进行 SDS电泳即可观察到高浓度的酶蛋白带,且条带单一,在上清中纯度高达总蛋白的 97%,非常适合于大规模工业生产和分离纯化。对粗酶的研究显示,D2蛋白酶在pH 7～10范围内酶活性均维持在最大酶活性的65%以上,是一种碱性蛋白酶;酶的最适温度为60℃,但在 10～90℃范围内均具有一定活性,活性温度范围广,而已报道的海洋细菌蛋白酶多为低温酶[3],其他来源的微生物蛋白酶则活性范围一般较窄。目前,已通过层析技术获得了小量 D2蛋白的酶的纯品,正在探索其最佳发酵产酶条件,从而为规模化发酵和工业化生产奠定基础。

[1] Kumar CG,Takagi H.Microbial alkaline proteases:from a bio2 industrial viewpoint[J].Biotechnol Adv,1999,17(7):5612 594.

[2] Saeki K,Ozaki K,Kobayashi T,et al.Detergent alkaline protea2 ses:enzymatic properties,genes,and crystal structures[J].J BiosciBioeng,2007,103(6):5012508.

[3] 陈静,王树军,黄炜,等.产低温碱性蛋白酶海洋适冷菌 SY的筛选[J].微生物学杂志,2005,25(4):38242.

[4] Rao MB,Tanksale AM,Ghatge MS,et al.Molecular and Bio2 technologicalAspects ofMicrobial Proteases[J].MicrobiolMol Biol Rev,1998,62(3):5972635.

[5] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[6] Leber T M,Balkwill FR.Zymography:A single step staining method for quantitation of proteolytic activity on substrate gels[J].Anal.Biochem,1997,249(1):24228.

[7] WhooleyMA,O’Callaghan JA,McLoughlin AJ.Effect of sub2 strate on the regulation of exoprotease production by Pseudo2 monas aeruginosa ATCC 10145[J].J GenMicrobiol,1983,129(4):9812988.

[8] PAN WD,L IU X,GE F,et al.Perinerin,a novel antimicrobial peptide purified from the clamwor m Perinereis aibuhitensis Grube and its partial characterization[J].J Biochem,2004,135(3):2972304.

[9] Miyaji T,Otta Y,Shibata T,et al.Purification and characteriza2 tion of extracellular alkaline serine protease from Stenotroph2 omonasmaltophilia strain S21[J].Lett Appl Microbiol,2005,41(3):2532257.

[10]Cao ZJ,Zhang Q,Wei DK,et al.Characterization of a novel Stenotrophomonas isolate with high keratinase activity and puri2 fication of the enzyme[J].J IndMicrobiolBiotechnol,2009,36(2):1812188.

Isolation and Identification of a High2Protease2Producing Stenotrophom onas m altophiliaStra in and Its Enzymatic Characteristics

YAN Zhi2yong1,B IChun2xia2,XIN Xiao2ni1,LUO Wei1,DA I Yu2mei1,WANGBin1
(1.Dept.of M icrobiol.,Med.Coll.,Qingdao Uni.;2.QingdaoM unicipal Hosp.,Qingdao266071)

A high2protease2producing bacteria,strain D2(CG MCC 1868),was isolated from the alimentary tract of Perinereis aibuhitensis.Based on the study of itsmorphologic and physiological properties,and phylogenetic analyses of the 16S rRNA gene sequence,strain D2 was confirmed to beStenotrophomonas m altophilia.Lowry method deter2 mined the enzymatic production capacity of the strain reached as high as 1 104 U/mL for 48 h2fer mentation in an opti2 mized production condition of pH 8.0 and 25℃.The enzyme was proved itsmolecularmass being 42 ku analyzed by casease atlasmethod and gel image,and its purity in fer mentation broth wasmore than 97%,the specific activity of the enzyme to the crude enzymewas301 U/mg.themost suitable pH of the enzymewas at9,being an alkaline prote2 ase,the most suitable temperature was 60℃,and fairly good stability at pH 6～10 and 0～55℃.Therefore,D2 strain might be a novel promising resource ofmarine microbial protease.

Stenotrophom onas m altophilia;identification;protease;activity

Q939

A

1005-7021(2010)05-0007-05

国家“973”计划基础前期研究专项(2004CCA02400);山东省科技公关 (2007GG3WZ05009);青岛市自然科学基金(072223282jch)

闫志勇 男,副教授,博士。主要从事细菌生物活性基因的分子生物学研究。

Tel:0532283780059,E2mail:yanzhiyong2001@126.com

2010208210;

2010209222