香丹滴丸的质量标准研究

李敏，雷庆忠，李桂生，李延团

(1.中国海洋大学，山东 青岛 266003； 2.山东省天然药物工程技术研究中心，山东 烟台 264003)

香丹滴丸的质量标准研究

李敏1*，雷庆忠2，李桂生2，李延团1

(1.中国海洋大学，山东 青岛 266003； 2.山东省天然药物工程技术研究中心，山东 烟台 264003)

目的：建立香丹滴丸的质量标准。方法：采用TLC鉴别制剂中的降香和丹参；采用HPLC测定制剂中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量，色谱条件分别为Discovery C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸(15∶65∶20∶0.3)和乙腈-水-甲酸(22∶78∶1.5)，检测波长为270nm和286nm。结果：在TLC色谱图中均能检测出降香和丹参。丹参酮ⅡA线性范围2.6～81.6μg·mL-1，回收率为99.19%，RSD=1.34%；丹酚酸B线性范围50～800μg·mL-1，回收率为98.84%，RSD=1.74%。结论：所建立鉴别方法专属性强，定量方法简便、准确,可用于香丹滴丸的质量标准控制。

香丹滴丸；HPLC；TLC；丹参酮ⅡA；丹酚酸B

香丹滴丸是由香丹注射液(部颁标准WS3-B-3289-98)改变提取工艺和剂型而来，具有扩张血管，增进冠状动脉血流量等功效，为了适应注射剂制备工艺要求，原制备工艺中主要提取降香和丹参两味药材的水溶性部分，弃去具有药理活性的脂溶性部分。大量文献和临床报道降香挥发油是降香药材的主要活性成分，具有行气止痛，活血止血作用，临床上主要用于冠心病的治疗[1,2]；丹参中脂溶性成分丹参酮和水溶性成分丹参酚酸类对心脏和血管性疾病都有很好的防治作用[3-5]。故我们在原剂型的基础上根据新剂型的特点及药效学研究结果，对原剂型中的降香和丹参提取工艺进行了重大改进，采用水蒸气蒸馏法提取降香中的挥发油，采用酸水渗漉法和乙醇渗漉法分别提取丹参中的酚酸类成分和菲醌类成分，制成滴丸剂。香丹滴丸原料是由丹参水提取物、醇提取物及降香挥发油组成，按照中医药理论，丹参善入心及心包经祛瘀止痛，活血通脉；降香能行气活血，止痛止血。丹参与降香等量相伍为用，气血并治，是一祛瘀行气止痛的佳方。为了有效地控制该制剂质量，保证其临床疗效，本实验采用TLC对制剂中的丹酚酸B、丹参酮ⅡA和降香挥发油进行了定性研究，同时采用HPLC对制剂中丹参的主要活性成分丹酚酸B和丹参酮ⅡA进行了含量测定,建立了可靠、准确、专属性强的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

TSP SpectraSYSTEM P1000型高效液相泵系统；TSP Spectra100紫外检测器；CHROMTEK色谱工作站；Discovery C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；CBL Model 100型柱温箱。

1.2 试药

丹酚酸B对照品(批号111562-200302)、丹参酮ⅡA对照品(批号110766-200416)、降香对照药材(批号120952-200506)均购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇为色谱纯，水为去离子水，其他试剂为化学纯；硅胶G薄层板(山东烟台化学工业研究所)；香丹滴丸(山东省天然药物工程技术研究中心自制，批号091006，091008，091010)。

2 薄层色谱鉴别

2.1 丹参酮ⅡA的TLC鉴别

取本品60丸，研碎，加75%甲醇10mL，超声处理10min，作为供试品溶液。另取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。再按处方配比，去除丹参，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)[6]，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-醋酸乙酯(19∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗红色斑点，阴性对照溶液无此斑点，见图1。

2.2 丹酚酸B的TLC鉴别

取本品60丸，研碎，加75%甲醇10mL，超声处理10min，精密吸取1mL，置10mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取丹参酚酸B对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；再按处方配比，去除丹参，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)[6]，吸取上述3种溶液各5μL,分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。结果在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照溶液无此斑点，见图2。

2.3 降香挥发油的TLC鉴别

取本品30丸，研碎，置具塞锥形瓶中，加乙醚10mL，振摇2min，滤过，滤液挥干，残渣加1mL乙醇溶解，作为供试品溶液。另取降香对照药材粉末约2g，加乙醚20mL，加热回流30min，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为对照品溶液。再按处方配比，去除降香，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录ⅥB)[6]，吸取上述3种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙醚-三氯甲烷(7∶2∶11)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸与无水乙醇(1∶9)的混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果在供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照溶液无此斑点，见图3。

1.丹参酮ⅡA对照品;2～4.香丹滴丸;5.缺丹参的阴性样品图1 香丹滴丸中丹参酮ⅡA的TLC色谱图1.丹参酚酸B对照品;2～4.香丹滴丸;5.缺丹参的阴性样品图2 香丹滴丸中丹参酚酸B的TLC色谱图1.降香对照药材;2～4.香丹滴丸;5.缺降香的阴性样品图3 香丹滴丸中降香挥发油的TLC色谱图

3 丹参酮ⅡA的含量测定

3.1 色谱条件

色谱柱为Discovery C18；流动相为乙腈-甲醇-水-磷酸(15∶65∶20∶0.3)；检测波为270nm；流速为1.0mL· min-1；柱温为35℃，HPLC图见图4。理论塔板数按丹参酮ⅡA计算,应不低于2 000。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成每1mL含丹参酮ⅡA0.018mg的溶液。

3.3 供试品溶液的制备

取本品10丸，研细，取约0.25g，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇溶液，超声处理10min，放冷至室温，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过,即得。

A.阴性对照品 B.丹参酮ⅡA对照品 C.香丹滴丸图4 阴性对照、丹参酮ⅡA对照品、香丹滴丸的HPLC图

3.4 阴性对照液的制备

阴性对照液的制备：丹参先以10倍量的0.01mol·L-1盐酸溶液渗漉，收集渗漉液，减压浓缩至相对密度为1.15(60℃)，加乙醇使含醇量达75%，静置24h，取上清液，备用；药渣继续用10倍量的95%乙醇渗漉，渗漉液滤过，滤液与上述上清液合并，减压浓缩并干燥，粉碎，即得丹参提取物。

取丹参提取物0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加0.01mol·L-1盐酸溶液10mL，超声处理20min，滤过，滤器与残渣用0.01mol·L-1盐酸溶液10mL洗涤，滤液与洗液合并，置50mL量瓶中，加入处方量的聚乙二醇4000、聚乙二醇6000及降香挥发油，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过,即得。

3.5 线性关系考察

精密吸取102μg·mL-1丹参酮ⅡA对照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mL置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别精密吸取20μL溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=104 009X+85 646，r=0.999 9。结果表明,丹参酮ⅡA浓度在2.6～81.6μg·mL-1具有良好的线性关系。

3.6 精密度试验

精密吸取上述供试品溶液20μL，依上述色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD=0.28%。

3.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24h进样，记录峰面积，结果丹参酮ⅡA峰面积的RSD=1.06%，表明供试品溶液在24h内稳定。

3.8 重现性试验

取同批供试品，按上述测定方法重复检测6次，测得本品丹参酮ⅡA平均含量为2.21mg·g-1，即0.12mg/丸，RSD=1.43%，表明本法的重现性良好。

3.9 回收率试验

采用加样回收法，取同一批已知丹参酮ⅡA适量的香丹滴丸细粉，精密称取6份，分别准确加入同量的对照品，各份均按上述色谱条件测定，结果见表1。

表1 丹参酮ⅡA加样回收率试验

注：丹参酮ⅡA照品加入量均为0.225mg

4 丹酚酸B的含量测定

4.1 色谱条件

色谱柱为Discovery C18；流动相为乙腈-水-甲酸(22∶78∶1.5)；检测波长为286nm；流速为0.7mL·min-1；柱温为35℃。HPLC图见图5。理论塔板数按丹参酚酸B计算，应不低于2 000。

A. 阴性对照品 B. 丹酚酸B对照品 C.香丹滴丸图5 阴性对照品、丹酚酸B对照品、香丹滴丸的HPLC图

4.2 对照品溶液的制备

精密称取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含丹参酚酸B0.20mg的溶液。

4.3 供试品溶液的制备

取本品10丸，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加0.01mol·L-1盐酸溶液25mL，超声处理20min，滤过，滤液置50mL量瓶中，滤器与残渣用适量0.01mol·L-1盐酸溶液分次洗涤，洗液与滤液合并，加0.01mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

4.4 阴性对照品溶液的制备

取丹参提取物0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加0.01mol·L-1盐酸溶液25mL，超声处理20min，滤过，滤器与残渣用0.01mol·L-1盐酸溶液25mL分次洗涤，弃去滤液，滤渣加20mL甲醇溶解，加入处方量的聚乙二醇4000、聚乙二醇6000及降香挥发油，置50mL量瓶中，加0.01mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

4.5 线性关系考察

精密吸取2.004mg·mL-1丹酚酸B对照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL分别置10mL量瓶中，加0.01mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密吸取20μL，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=33 169X+2×106，r=0.999 6。结果表明，丹酚酸B浓度在50～800μg·mL-1具有良好的线性关系。

4.6 精密度试验

精密吸取上述供试品溶液20μL，依上述色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，结果其RSD=0.72%。

4.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0,2,4,8,16,24h进样，记录峰面积，结果丹酚酸B峰面积的RSD=0.38%，表明供试品溶液在24h内稳定。

4.8 重现性试验

取同批供试品，按上述测定方法重复检测6次，测得本品丹酚酸B平均含量为23.5mg·g-1，即1.29mg/丸，RSD=1.34%，表明本法的重现性良好。

4.9 回收率试验

采用加样回收法，取同一批已知丹酚酸B含量的香丹滴丸细粉，精密称取6份，分别准确加入同量的对照品，各份均按上述色谱条件测定，结果见表2。

表2 丹酚酸B加样回收率试验

注：丹酚酸B对照品加入量均为4.47mg

5 样品含量测定

按供试品制备及含量测定方法测定了091006，091008，091010 3批香丹滴丸样品，丹参酮ⅡA的含量分别为1.27，1.17，1.21mg/丸，丹酚酸B的含量分别为0.12，0.09，0.11mg/丸。

6 讨论

采用HPLC分别对丹参酮ⅡA和丹酚酸B进行含量测定，在方法学研究中，为了避免丹参酮ⅡA和丹酚酸B对彼此色谱条件的影响，故在阴性对照液的制备中选用丹参提取物而不选用去除丹参的空白滴丸。由两阴性对照液HPLC图可以看出，丹参酮ⅡA阴性对照液色谱图中只有一杂质峰(2.9min)，在对照品相应位置(13.0min)上没有吸收峰，丹酚酸B阴性对照液色谱图中没有吸收峰，且在两供试品溶液HPLC图中主峰与杂质峰均能达到完全分离，即两色谱条件用于有效成分的含量测定具有良好的可行性。

[1] 李燕梅.冠心丹参滴丸临床应用体会[J].中国中西医结合急救杂志，2002，9(5)：269.

[2] 韩静，唐星，巴德纯.降香挥发油的理化性质研究[J].中医药学刊，2004，22(7)：1292-1294.

[3] 李琳,孙莉莎,徐江平.丹参酚酸B对犬心肌梗死的治疗作用[J].中药学,2004,26(3)：215-218.

[4] 赵桂峰,张红霞.丹参酚酸B对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].辽宁中医学院学报,2004,6(1)：55-56.

[5] 张洁,曾晓荣,扬艳,等.丹参酮Ⅱ-A磺酸钠对原代培养猪冠脉平滑肌钙激活钾通道的影响[J].泸州医学院学报,2000,23(5)：380-383.

[6] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005：附录37.

QualityStandardforXiangdanDroppingPills

Li Min1, Lei Qingzhong2, Li Guisheng, Li Yantuan1

(1.OceanUniversityofChina,QingdaoShandong266003,China； 2.ShandongEngineeringResearchCenterforNaturalDrugs,YantaiShandong264003,China)

Objective: To establish the quality standard for Xiangdan Dropping Pills.Methods:Dalbergiaodorifera,Salviamiltiorrhizaof Xiangdan Dropping Pills were identified by TLC. The contents of

tanshinoneⅡAand salvia acid B were determined by HPLC. Methyl-methanol-water-phosphoric-acid (15∶65∶20∶0.3) and methyl-water-methanoic-acid(22∶78∶1.5) were used as mobile phase respectively.Results:Dalbergiaodorifera,Salviamiltiorrhizacan be identified by TLC.The calibration curves of tanshinoneⅡAwas linear within 2.6～81.6μg·mL-1.The average recovery was 99.19%,RSD was 1.34%.The calibration curves of salvia acid B was linear within 50～800μg·mL-1.The average recovery was 98.84%, RSD was 1.74%.Conclusion: The method is simple, accurate and reliable. It can be used for quality control of Xiangdan Dropping Pills.

Xiangdan Dropping Pills; HPLC; TLC; TanshinoneⅡA; Salvia acid B

*李敏，E-mail：limin@luye-pharm.com

2010-03-29)