氯化锂-匹罗卡品致大鼠的模型研究*

龙莉莉,肖波,李国良,李蜀渝,易芳,陈锶,毕方方

中南大学湘雅医院神经内科,长沙 410008

龙莉莉,肖波#,李国良,李蜀渝,易芳,陈锶,毕方方

中南大学湘雅医院神经内科,长沙 410008

目的:探讨氯化锂(LiCl)-匹罗卡品(PILO)致大鼠的行为学特征及海马病理改变。方法:建立改良的LiCl-PILO致大鼠模型,观察大鼠行为,尼氏染色观察不同时间点大鼠海马病理改变,FJB染色观察大鼠海马神经元及其轴突、树突变性。结果:大鼠腹腔注射LiCl-PILO后,癫持续状态(SE)诱发成功率为92.5%,死亡率21.25%;尼氏染色结果显示,实验组大鼠海马神经元于SE后7 d和60 d缺失最明显,与对照组相比,齿状回颗粒细胞减少(P＜0.05),CA 1、CA 3区锥体细胞和门区神经元均显著减少(P＜0.01);FJB染色结果显示,实验组大鼠海马神经元于SE后7 d和60 d变性最明显,主要集中在CA 1、CA 3区锥体细胞层和门区,SE后7 d海马腔隙-分子层亦可见变性的神经元轴突和树突。结论:改良后的LiCl-PILO致模型SE诱发成功率高,死亡率低,可基本复制人类颞叶癫的发作特点及病理改变;颞叶癫海马神经元的缺失可能是由于神经元的变性死亡。

颞叶癫;氯化锂-匹罗卡品;大鼠;海马

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物:6～8周龄健康雄性SD大鼠120只,体质量(250±20)g,由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供,在室温18～25℃、相对湿度50%～60%、人工12 h昼/夜循环照明环境中用全价营养饲料分笼饲养,能自由摄食及饮水,每日定时清洗笼舍。②主要试剂与材料:LiCl、0.1%焦油紫(购于美国 Sigma公司);PILO(购于美国Boehringer M annheim公司);FJB(购于美国Chemicon公司);冰冻切片机(购于德国SLEE Tecknik公司);LSM 510型激光共聚焦显微镜(购于德国ZEISS公司);HPIAS-1000高清晰彩色病理图象分析系统(购于武汉大学影像工程公司)。

1.2 方法

1.2.2 标本取材与制备 在各时间点以4%多聚甲醛对大鼠进行灌注取材,取脑置4℃4%多聚甲醛固定过夜后,蔗糖过夜沉底。冰冻切片机行20μm脑冠状连续切片(隔3取1,每只大鼠取4套),收集有海马的脑片置于0.01mo l/L磷酸盐缓冲液中。将脑片贴片于用多聚赖氨酸包被的载玻片上,切片充分晾干后,-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 尼氏染色 切片自-80℃冰箱取出后晾干,蒸馏水漂洗,0.1%焦油紫室温下染色10min,镜下观察,如染色过深,将切片浸入95%乙醇中分色,镜下监视至满意效果;自来水冲洗,脱水(70%乙醇3m in、95%乙醇3min、100%乙醇1m in×3次),二甲苯透明(5min×2次),中性树脂封片;镜下观察海马区域的病理改变。

1.2.4 FJB染色 50℃烤箱内使切片充分干燥(≥0.5 h),浸入蒸馏水2m in,浸入含1%NaOH的80%乙醇(20m L 5%NaOH加入80m L无水乙醇中)内5m in;浸入70%乙醇2min,浸入蒸馏水2min,浸入0.06%高锰酸钾溶液10min(摇床上轻微振动以使背景均匀),蒸馏水漂洗 2 m in后放入0.0004%FJB溶液(4m L 0.01%FJB固定液加入96m L 0.1%醋酸)染色20 min(该步骤及以下步骤均在暗室中进行),蒸馏水漂洗1min×3次后,倾掉剩余水,50℃烤箱内充分烤干(约5～10min),二甲苯透明≥1min,中性树脂封片,激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.5 细胞计数 用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像分析系统对切片进行图像分析,由2名不熟悉实验的技术员进行尼氏染色的神经元计数。每个时间点每只大鼠随机选3～4张脑切片,每组24张切片,用于细胞计数及统计学分析。2组大鼠选取断面水平相似的组织切片,所有切片在相同强度及相同放大倍数下进行观察计数。在40倍物镜下,对CA 1、CA 3区锥体细胞层、齿状回颗粒细胞层和门区随机选取5个不重叠视野,计算每个视野神经元数目,取均数作为各时间点各区域尼氏染色的细胞数目。

1.3 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件处理数据,结果以(x±s)表示,成组设计多样本均数用单因素方差分析,2组之间比较用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学特征 LiCl腹腔注射后,实验组大鼠的行为活动无变化;PILO注射5～30min后,大鼠开始呈现外周胆碱能反应:立毛、流涎、颤抖及流血泪,同时或先后出现刻板行为:凝视不动、咀嚼、吸鼻或探索行为、湿狗样震颤、反复头颈上仰,随后出现眨眼、面肌痉挛、点头,最后出现反复双侧前肢阵挛,伴直立、跌倒或翻转,部分动物出现四肢强直-阵挛发作。开始发作不频繁,随时间延长发作频率增高。实验组中74只达到RacineⅢ～Ⅴ级并进入SE;进入SE后,13只抽搐致死,其余大鼠在24～72 h后进入静止期;静止期大部分行为正常,4只抽搐严重的大鼠进入静止期后活动迟钝,不能主动进食水,数天后衰竭死亡;存活的大鼠在15～45 d后均出现自发性强直-阵挛性发作,持续时间短,约0.5～1min,发作次数从1 d数次至数天1次,慢性期内无死亡。SE诱发成功率为92.5%,总死亡率为21.25%,模型成功率为71.25%。

2.2 尼氏染色结果 对照组大鼠CA1、CA 3区及齿状回有大量致密的锥体细胞及颗粒细胞,门区有中等量神经元,排列整齐,形态完整,胞浆内尼氏小体丰富。PILO致SE后,海马齿状回、门区和CA 1、CA 3区均有不同程度神经元减少;CA 1和CA3区锥体细胞层神经元排列紊乱,可见部分形态不完整,细胞肿胀或皱缩、轮廓模糊、界限不清,细胞间距加大,胞浆尼氏小体减少,齿状回颗粒细胞边界不整齐,排列松散、增宽,呈现发散改变;SE后7 d和60 d,CA1区胶质细胞增生明显。急性期和静止期以SE后7 d神经元减少最明显,与对照组相比,齿状回颗粒细胞减少(P＜0.05),CA1、CA 3区及门区神经元均显著减少(P＜0.01);慢性自发发作期以SE后60 d神经元减少最明显,与对照组相比,CA 1区锥体细胞缺失最严重(P＜0.01),CA3区锥体细胞和门区神经元显著减少(P＜0.01),齿状回颗粒细胞也出现丢失(P＜0.05),见表 1,图 1A-1L 。

2.3 FJB染色结果 FJB染色检测实验组大鼠海马变性神经元结果显示,各时间点中,SE后7 d和60 d神经元变性最明显。SE后7d,CA 1区和门区均可见FJB染色阳性的变性神经元,在CA1区变性主要集中于锥体细胞层;CA 3区未见明显FJB标记的神经元;海马腔隙-分子层可见变性的神经元轴突及树突。SE后60 d,CA 1区、CA3区和门区均可见明显的变性神经元及其轴、树突,变性在CA 1和CA 3区主要集中于锥体细胞层,CA 1区始层和辐状层亦有少许,见图2A-2F。

表1 2组大鼠SE后 7 d及60 d海马不同部位尼氏染色神经元计数(x-±s,个)

图 1A-L 对照组海马(A)、CA 1区(D)、门区(G)、CA 3区(J),实验组大鼠SE后7 d海马(B)、CA 1区(E)、门区(H)、CA 3区(K),SE后60 d海马(C)、CA 1区(F)、门区(I)、CA 3区(L)尼氏染色结果 A-C:比例尺为 200μm,D-I:比例尺为100μm,J-L:比例尺为50μm

3 讨论

图2 A-F 实验组大鼠SE后7 d CA 1区(A)、门区(B)、海马腔隙-分子层(C),SE后60 d CA 1区(D)、门区(E)、CA 3区(F)FJB染色结果 A,B,D,E,F:比例尺为50μm,C:比例尺为20μm

以海马神经元变性缺失和神经胶质增生为主要表现的海马硬化是颞叶癫的标志性病理改变[13],约60%～70%的颞叶癫患者伴有海马硬化[14]。海马硬化最早由Falcomer等[15]提出,又称为颞叶内侧硬化(medial tem poral sclerosis)或Ammon角硬化(Ammon's sclerosis),其主要病理改变为,CA 1区和CA 3区锥体细胞严重缺失,门区神经元减少,齿状回颗粒细胞减少。神经元丢失具有一定区域选择性,一般以CA1起始部最明显,其次为齿状回门区和CA 3区,齿状回颗粒细胞层受累相对轻微,下托(subicu lum)不受累或轻度受累,另外可能见到杏仁核神经元减少伴胶质增生[15]。本研究尼氏染色结果显示,PILO致后CA 1、CA3区锥体细胞和门区神经元大量减少,齿状回颗粒细胞部分减少,可见胶质细胞增生;FJB染色显示CA 1、CA 3区和门区有部分变性神经元;以上改变均类似于人类颞叶癫海马硬化的病理特征。尼氏染色所示的神经元缺失与FJB染色所示的变性神经元增多相对应,提示颞叶癫海马神经元的缺失可能是由于神经元的变性死亡。

[1]Scharfm an HE.The Neurobiology of Epilepsy[J].Curr Neuro l Neurosci Rep(S1528-4042),2007,7(4):348-354.

[2]Berg AT.Defining Intractable Epilepsy[J].Adv Neurol(S0091-3952),2006,97(1):5-10.

[3]K litgaard H,Matagne A,Vanneste-Goemaere J,et al.Pilocarpine-induced Epilep togenesis in the Rat:Im pactof Initial Duration of Status Epilep ticus on Electrophysiological and Neuropathological A lterations[J].Epilepsy Res(S0920-1211),2002,51(1-2):93-107.

[4]Löscher W.Animal M odels of Epilepsy for the Development of Antiepileptogenic and Disease-modifying Drugs.A Comparison of the Pharmacology of Kind ling and Post-status Epilepticus Models of Tem poral Lobe Epilepsy[J].Epilepsy Res(S0920-1211),2002,50(1-2):105-123.

[5]李国良,肖波,谢光洁,等.匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型[J].湖南医科大学学报,2003,28(1):29-32.

[6]Schmueda LC,Hopkinsa KJ,Fluoro-Jade B.A H igh A ffinity Fluorescent Marker for the Localization of Neuronal Degeneration[J].Brain Research(S006-8993),2000,874(2):123-130.

[7]Racine RJ.Modification of Seizure Activity by Electrical Stimu lationⅡMotor Seizure[J].Electroencephogr Clin Neurophysiol(S0013-4694),1972,32(3):281-294.

[8]Proper EA,Jansen GH,van Veelen CW,et al.A G rading System for Hippocampal Sclerosis Based on the Degree of Hippocampal M ossy Fiber Sprouting[J].Acta Neuropathol(S0001-6322),2001,101(4):405-409.

[9]Clifford DB,Olney JW,Maniotis A,et al.The Functional Anatomy and Pathology of Lithium-pilocarpine and High-dose Pilocarpine Seizures[J].Neuroscience(S0306-4522),1987,23(3):953-968.

[10]LiWE,Nagy JI.Activation of Fibres in Rat Sciatic Nerve A lters Phosphory lation State of Connexin-43 at Astrocy tic Gap Junctions in Spinal Cord:Evidence for Junction Regulation by Neuronal-glial Interactions[J].Neuroscience(S0306-4522),2000,97(1):113-123.

[11]G lien M,Brandt C,Potschka H.et al.Repeated Low-dose T reatment of Rats with Pilocarpine:Low Mortality but High Proportion of Rats Developing Epilepsy[J].Epilepsy Res(S0920-1211),2001,46(2):111-119.

[12]Cou lter DA,McIntyre DC,LöscherW.Animal Models of Limbic Epilepsies:what can they Tell us[J]?Brain Pathol(S1015-6305),2002,12(2):240-256.

[13]Hogan RE,Bucholz RD,JoshiS.Hippocampal Deformation Based Shape Analysis in Epilepsy and Unilateral M esial Tem poral Sclerosis[J].Epilepsia(S0013-9580),2003,44(6):800-806.

[14]吴逊.癫痫与发作性疾病[M].北京:人民军医出版社,2001:6-22.

[15]Falconer MA,Serafetinides EA,Corsellis JA.Etiology and Pathogenesis of Temporal Lobe Epilepsy[J].A rch Neurol(S0003-9942),1964,10:233-248.

[16]Yang ZX,Luan GM,Yan L,et al.Establishment of Temporal Epilepsy M odels and Its Permanent Epilepsy Sensitivity[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi(S0376-2491),2004,84(2):152-155.

[17]Cascino GD.Tem poral Lobe Epilepsy:More than H ippocampal Patho logy[J].Epilepsy Curr(S1535-7597),2005,5(5):187-189.

A Rat Temporal Lobe Epilepsy M odel Induced by LiCl-pilocarpine

LONG Li-li▲,X IAO Bo,LI Guo-liang,LIShu-yu,YI Fang,CHEN Si,B I Fang-fang.▲Department of Neurology,X iangya Hospital of Central South University,Changsha 410008,China

Ob jective:To investigate the behavioral characteristics and neuro-histological progression of hippocam pus in lithium-pilocarpine induced tem poral lobe epilepsy m odel in rats.Methods:M odified LiCl-pilocarpine induced animalm odel w as estab lished.Nissl stainning was used to observe the pathological changes of hippocam pus;FJB stainning was used to detect the degeneration of hippocam pal neurons and their neurophils.Results:A fter lithium-chloride and pilocarpine administration,92.5%rats generated SE successfu lly,and the Mortality rate was 21.25%.Nissl stain revealed that loss of hippocam palneurons wasmostevident on 7 d and 60 d after SE.Significant lossof hilar neurons and pyramidal neurons was present in CA 1 area(P＜0.01),while loss of the granu lar cells in the dentate gy rusw as relatively slight(P＜0.05).FJB stain showed that degeneration of the hippocampalneurons wasmost evidenton day 7 and day 60 after SE,main ly restricted in the pyramidal layer and hilar area.Degenerated neurophils cou ld be seen in the lacunosum-moleculare(lm)layer on 7d after SE.Conclusion:M odified LiCl-pilocarpine induced temporal lobeepilepsy model could generate SE in rats successfully with low mortality.It canm imic the clinical features and pathologic changes of hum an temporalepilepsy.Loss of neurons in the hippocampusof temporal lobeepilepsy may be due to the cellular degeneration and death.

temporal lobe epilepsy;LiCl-pilocarpine;rat;hippocam pus

R741;R742.1

A

1001-117X(2010)02-0083-06

10.3870/sjsscj.2010.02.002

卫生部部属医院临床学科重点项目(2007-353);湖南省科技厅科技计划项目(2007TP4005)

2009-12-30

#【通讯作者】肖波,Tel:86-731-84327236,E-mail:xiaobo62_xy@yahoo.com.cn。