应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶

李梓君,方柏山,杨仲丽,刘嘉

(华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室,福建泉州 362021)

应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶

李梓君,方柏山,杨仲丽,刘嘉

(华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室,福建泉州 362021)

经过连续易错聚合酶链式反应(Erro r-Prone PCR)向克雷伯杆菌(K lebsiella pneumoniae)甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变(A 964T),该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol·L-1升高至0.63 mmol·L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol·L-1升高至0.77 mmol·L-1,并且酶的最适p H值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65℃降至55℃.

甘油脱氢酶;克雷伯杆菌;定向进化;易错聚合酶链式反应

甘油脱氢酶(Glycerol Dehydrogenase,GDH)主要催化甘油生成二羟基丙酮(Dihydroxyacetone, DHA).根据催化反应中产物和电子受体的不同,GDH可分为3种类型[1].第1种为依赖NAD+的GDH[2](EC1.1.1.6),主要存在于各种细菌中,如Aerobacter aerogenes,Escherichia coli,Bacillus substilis和Cellu lom onas sp.等.第2种为依赖NADP+的 GDH(EC1.1.1.72和EC1.1.1.56),大多存在于霉菌和动物组织中[3].第3种为不依赖辅酶位于细胞膜上的 GDH,在醋酸菌中发现存在这类GDH[4].GDH的催化产物DHA因其分子中含3种官能团,化学性质活泼,广泛参与聚合、缩合等反应,所以被广泛应用于轻工、医药和食品等行业[5].由于应用过程中常常需要酶在长时间内,以及在极端环境中保持较高活性,所以需要对天然的甘油脱氢酶进行改造.酶的定向进化是在体外模拟自然进化的过程,不需事先了解酶的空间结构和催化机制,通过人为地创造特殊的条件,模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择出所需性质的突变酶.易错PCR以其操作简便、有效等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一[6].本研究利用易错PCR对克雷伯杆菌中 GDH进行定向进化,以期获得酶活大幅提高,酶学性质有所改善的突变酶.

1 实验材料和方法

1.1 菌株与质粒

E.coliBL21(DE3)(p ET-32gldA)的构建,以及表达载体p ET-32a(+)、菌株和质粒的保存,均由华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室完成.

1.2 试剂

LB培养基.T4 DNA连接酶、dN TPs,限制酶、r Taq酶,购自大连TaKaRa公司.胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自美国Omega公司,辅酶Ⅰ购自Amersco公司,其余试剂均为国产分析纯.

1.3 定向进化方法

1.3.1 甘油脱氢酶基因突变体文库构建 (1)引物.PrimerⅠ为5’-CGTCGGA TCCTACA TGCGCACTTA TTTGAG-3’);PrimerⅡ(5’-AA TGCTCGAGCGAA TTAACGCGCCAGCCAC-3’).

(2)易错PCR反应体系.20μL体系中含1×Taq DNA聚合酶缓冲液、0.2 mmol·L-1dA TP和dGTP,1 mmol·L-1dCTP和d TTP,6.0～8.5 mmol·L-1M g2+,0.3～0.8 mmol·L-1M n2+,1 mmol·L-1PrimerⅠ和PrimerⅡ,模板DNA为质粒p ET-32gldA约50 ng.其中,M g2+和M n2+的浓度被调整,可以得到不同突变频率的文库.

(3)扩增与鉴定.94℃,5 min;94℃,1 min;62℃,1.5 min;72℃,1.5 min;30个循环;72℃,15 min.用质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定易错PCR产物,利用胶回收试剂盒切胶回收PCR产物,于-20℃保存.

(4)文库构建.将上述易错PCR产物经胶回收纯化后,经Bam H I-XhoⅠ双酶切,与同样双酶切的载体p ET-32a(+)相连接,重组子引入E.coliBL 21(DE3),构建突变体文库.

1.3.2 突变体的筛选和鉴定 (1)筛选模型的建立[7].将菌体用无菌水稀释,涂布于番红O筛选平板(胰蛋白胨6.0 g·L-1,酵母浸膏 3.0 g·L-1,氯化钠 10.0 g·L-1,甘油 18.4 g·L-1,番红O 0.1 mmol·L-1,IPTG 1.0 mmol·L-1,氨苄青霉素75.0 mg·L-1,琼脂粉10.0 g·L-1),观察平板的单菌落的生长及变色情况.挑取颜色显示均匀桃红色的单菌落置于含75 mg·L-1氨苄青霉素的LB液体培养基中培养,经乳糖诱导后收集菌体进行复筛鉴定.

(2)阳性转化子的鉴定.按质粒提取试剂盒方法抽提正向重组质粒,经 HindⅢ,PstⅠ单双酶切,用质量分数为0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物.

1.4 诱导表达

挑取阳性克隆单菌落接种于含有75 m g·L-1氨苄青霉素的LB培养基中,于30℃培养至吸光度值(D)约0.4时,加入乳糖至终质量浓度为2 g·L-1,于30℃下诱导培养5 h后离心收集菌体.

1.5 进化酶酶活力及菌体蛋白含量测定

酶活力测定具体方法参照文[8].GDH使甘油脱氢生成二羟基丙酮,同时辅酶 ⅠNAD+被还原为NADH.NADH在340 nm的紫外光下有最大吸收,根据吸光度的增加情况,用初速度法可测定 GDH的活力.取1.5 mL反应液(含30 mmol·L-1(NH4)2SO4,0.2 mol·L-1甘油,2 mmol·L-1NAD,1 μmol·L-1Fe(NH4)2(SO4)2,0.1 mol·L-1碳酸钾缓冲溶液,p H=12.0),于45℃下恒温后,加入适量酶液启动反应,在340 nm波长下连续测定酶反应过程中的吸光值(每隔6 s记录一个数据,时间1 min),通过计算可得到GDH的酶活(z).酶活的定义:在上述条件下,每分钟还原1μmol甘油的酶量为1个酶活力单位.蛋白含量按Bradford法测定[9],以牛血清白蛋白为标准蛋白质.

1.6 突变基因序列测定

对筛选到的阳性克隆进行培养复筛,挑选在高p H值条件下仍有较高酶活力的突变体,提取质粒并用自动序列仪进行测序.测序由辽宁省大连宝生物公司完成.

1.7 进化酶的纯化

按照常规方法进行镍柱亲和层析纯化[8].SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺胶体电泳):采用12%分离胶的不连续垂直平板电泳,考马斯亮蓝G-250染色.

2 实验结果

2.1 易错聚合酶链式反应

在高离子浓度M g2+或M n2+存在的条件下,Taq DNA聚合酶的保真性大大降低.在延伸的过程中,一些碱基被错误地引入到基因中,从而使基因发生突变.通过改变M g2+和M n2+的浓度,可以得到不同突变频率的片段多样性文库.在其他成分恒定的条件下,选择不同浓度的M g2+,M n2+进行易错PCR,结果如图1所示.图1(a)中,1～6表示M g2+浓度分别为6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5 mmol·L-1;图1(b)中,1～6表示M n2+浓度分别为0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mmol·L-1.

从图1可知,M gCl2浓度范围在7.0～8.5 mmol·L-1间均适合该基因易错PCR反应.为了确保易错PCR的突变率控制在每个基因1～3个碱基突变,选择M gCl2浓度7.0 mmol·L-1作为该基因易错PCR反应体系的最适浓度.在以上实验得到的最适M gCl2浓度的基础上,进一步考察不同M n2+浓度对反应体系的影响.结果表明,M n2+最适浓度为0.5 mmol·L-1.

图1 不同离子浓度下的易错PCRFig.1 Erro r-p rone PCR conducted with different ion concentration

2.2 突变体文库的构建及突变株的筛选和鉴定

在确定的易错PCR条件下扩增甘油脱氢酶基因,经连续易错PCR,产物经纯化后用Bam HⅠ-XhoⅠ双酶切,与经过同样双酶切的表达载体p ET-32a(+)相连接.连接产物转化至E.coliBL 21(DE3)感受态细胞中构建突变文库.研究中共获得5 000余株的突变株.

2.2.1 突变株的初筛 将转化后的E.coliBL 21(DE3)细胞涂布于番红O筛选平板上,在37℃下培养约12 h,对突变体进行筛选.甘油脱氢酶在催化甘油生成二羟基丙酮的同时,把 NAD+转化成NADH.所生成的NADH会通过呼吸链使电势升高,产生强质子流,增强了大肠杆菌细胞对番红O的摄入,并使得番红O在大肠杆菌内聚集[7,10].通过番红O筛选平板涂布,具有甘油脱氢酶活性的克隆显示均匀的桃红色,而无活性的克隆外围则有一个透明圈,如图2所示.

图2 番红O筛选平板初筛结果Fig.2 The screening result in safranin O plates

2.2.2 突变株的复筛 将初筛获得的克隆子接种于LB培养基(含75 mg·L-1氨苄青霉素)中,在30℃下培养至D约0.4时,加入乳糖至终质量浓度为2 g·L-1;30℃诱导培养5 h后,超声破碎菌体并离心收集上清液.采用96孔板结合酶标仪,测定初筛获得的菌株在不同p H值下的酶活,最终获得最佳突变体gldA-74,其甘油脱氢酶活力为2.202 m kat·L-1.

相比由张婷婷等[8]构建的亲本重组酶(酶活为0.805 mkat·L-1),酶活提高2.73倍;而相比于陈宏文等[1]由出发菌克雷伯杆菌经培养基和培养条件优化后,所测得无细胞抽提液的酶活0.062 m kat· L-1,酶活提高35.7倍.

2.2.3 突变株酶切鉴定结果 将均匀桃红色的克隆子在LB液体培养基中进行培养,然后抽提重组质粒.重组质粒用HindⅢ进行单酶切鉴定时,应出现约6 987 bp大小的一条带;而用 HindⅢ/PstⅠ进行双酶切鉴定时,由于gldA-74上还存在两个PstⅠ酶切位点,应得到两条DNA条带,其大小分别约为4 808,1 584 bp.

酶切鉴定结果表明连接正确,如图3所示.图3中:1,2分别为经 HindⅢ和经 HindⅢ/PstⅠ进行酶切p ET-32gldA-74.

2.2.4 进化酶与亲本重组酶序列比较结果 突变后的基因委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序,将进化酶与亲本重组酶基因序列进行对比.测序结果表明,利用易错PCR的方法,成功地向甘油脱氢酶基因引入了突变,其中酶活力增高、最适p H值增大的gldA-74突变体酶基因有1个碱基发生了突变(即964位的A变为T).这处突变使得322位的I(异亮氨酸)突变为F(苯丙氨酸).

2.3 甘油脱氢酶的分离与纯化

选用的表达载体p ET-32a(+)中含有表达His6-Tagged的基因序列,进化酶含有该融合标签,可以用镍柱纯化.另外,在该进化酶的N端还含有一个Rrx-Tag TM,该融合标签有利于提高目的蛋白的可溶部分比例及活性.研究中,进化酶经镍柱亲和层析纯化后可见单一条带,而穿透液几乎不含该条带,基本上可以认为得到比较纯的蛋白.

当以p ET-32a(+)为表达载体时,表达的目标蛋白所含的融合基因的相对分子质量约为20.4 ku,而研究中的 GDH的相对分子质量约为34 ku[1].因此,突变质粒所表达的融合蛋白的相对分子质量应为54 ku,如图4所示.图4中:1,2,3分别为纯蛋白、穿透液和粗蛋白.

表1为纯化结果.表1中:mt为总蛋白量;zt为总活力;ρ为蛋白质量浓度;σ为比活力;η为回收率;n为纯化倍数.从表1可以看出,纯化后进化酶的回收率为24.1%,纯化倍数是2.1.

图3 表达载体酶切鉴定Fig.3 Enzyme digestion of exp ression vector

图4 进化酶的纯化Fig.4 Purification of evolved emzyme

表1 进化GDH的纯化Tab.1 Purification of evolved GDH

2.4 甘油脱氢酶的酶学性质分析

2.4.1 酶动力学参数比较 亲本重组酶与进化酶都以1/V和1/S作Lineweaver Burk双倒数图,结果如图5所示.由此计算,得到亲本重组酶的Km(甘油)为0.58 mmol·L-1,Km(NAD)为0.74 mmol· L-1,Vmax(甘油)为0.75 mmol·(L·min)-1,Vmax(NAD)为0.96 mmol·(L·min)-1;进化酶的Km(甘油)为0.63 mmol·L-1,Km(NAD)为0.77 mmol·L-1,Vmax(甘油)为3.69 mmol·(L·m in)-1,Vmax(NAD)为4.75 mmol·(L·min)-1.

2.4.2 最适温度比较 亲本重组酶与进化酶的最适反应温度,如图6所示.从图6可见,亲本重组酶的最适温度为65℃,说明GDH能在较高的温度下进行反应.但是,再继续升高温度,酶活力迅速下降;在70℃时,残留的相对酶活力仅有20%.由图6又可知,进化酶的最适温度为55℃,比亲本重组酶的最适温度降低了10℃.在50～60℃范围内,进化酶的相对酶活均维持在80%以上.

2.4.3 最适p H值的比较 在45℃,不同p H值的缓冲液中,检测亲本重组酶和进化酶活力,结果如图7所示.由图7可以看出,甘油脱氢酶的酶活随着反应液p H值的变化而变化.亲本重组酶在p H值为11.0时,甘油脱氢酶的酶活最大;而在p H值为10～12时,GDH的相对活性能保持在70%以上.

图5 酶动力学参数的Line weaver Burk双倒数图Fig.5 Enzyme kinetic parameters of the Line weaver Burk double-reciprocal graph

由图7还可以看出,进化酶在p H值为12.5时酶活最大,比亲本重组酶的最适p H值高.在p H值为10～13时,进化酶的相对活性能保持在70%以上.中性环境酶活损失很大,在p H值为7的条件下,酶活仅为20%左右.进化酶催化反应耐强碱,说明 GDH存有较大的工业应用价值.

图7 pH值对酶活力的影响Fig.7 the effect of reaction pH on the specific activity of recombinant GDH and evolved GDH

图6 温度对酶活力的影响Fig.6 Effect of reaction temperature on the activity of recombinant GDH and evolved GDH

3 讨论

易错PCR操作简单,容易引入点突变.其突变频率高于传统的物理和化学诱变,是目前定向进化领域最为常用的随机突变手段.因此,采用易错PCR对GDH进行定向进化.

首先运用番红O筛选平板对5 000余株突变体进行初筛;然后,再利用96孔板结合酶标仪测定经初筛所得的菌株在不同p H值条件下的酶活,最终成功获得突变体gldA-74.该突变体有一个有益突变(即I322F),使得进化酶的酶活是亲本重组酶的2.73倍.

将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经镍柱纯化后,其酶学性质测定表明:Km(甘油)由0.58 mmol·L-1升高至0.63 mmol·L-1,Km(NAD)由0.74 mmo l·L-1升高至0.77 mmol·L-1,并且酶的最适p H值也由11.5升高至12.5,最适温度由65℃降至55℃.综上所述,最终获得的突变体gldA-74与亲本重组酶相比,具有较高的催化活力和偏碱的最适p H值,更适合在偏碱的环境中应用.

今后的研究方向有以下几个方面:(1)应用生物信息学工具,对定向进化后的突变基因库、蛋白质序列、3D结构、活性与功能的变化等做比对分析;(2)从根本上揭示突变酶的催化机理和折叠机制、蛋白质一级序列与三级结构的关系,以及结构与功能的关系等,为探索酶法同时合成DHA和1,3-PD的新途径提供理论依据.

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(责任编辑:黄仲一英文审校:陈国华)

Directed Evolution of Glycerol Dehydrogenase by Error Prone PCR

L IZi-jun,FANGBai-shan, YANG Zhong-li,L IU Jia
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology Fujian Province,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

The GDH enzyme gene fromKlebsiella pneumoniaewas repeatedly amp lified by two sequential error-prone polymerase chain reaction(PCR),and the gene library was built.The mutant can catalyze safranin O to show colors,and on the base of this property,the gldA-74 mutant was obtained by high throughput screening method using active agar plates in combination with 96-wellmicrop lates.The activity of the gldA-74 mutant was showed 2.73 fold of that of the parent recombinase.Gene analysis of the gldA-74mutant indicated that the mutant enzyme had a pointmutation(A 964T) which resulted in an amino acid being rep laced.Then,the highly exp ressed productions of recombinase GDH and evolved GDH were purified by Ni-NTA and the enzymatic properties were determined.The results showed that theKmof GDH increased from 0.58 mmol·L-1to 0.63 mmol·L-1,and theKmof NAD increased as well,from 0.71 mmol·L-1to 0.77 mmol·L-1.The op timum pH of mutant enzyme also increased from 11.5 to 12.5 while the op timum temperature decreased from 65℃to 55℃.

glycerol dehydrogenase;Klebsiella pneumoniae;directed evolution;error-prone polymerase chain reaction

Q 554+.903

A

1000-5013(2010)06-0661-06

2008-12-28

方柏山(1957-),男,教授,主要从事生物化工的研究.E-mail:fangbs@hqu.edu.cn.

国家重点基础研究发展(973)计划项目(2006AA 020103);国家自然科学基金资助项目(20676048)