纳米活性炭，纳米二氧化硅和纳米二氧化钛对人胃肿瘤BGC-823细胞的毒性作用

曲秋莲，张英鸽

(军事医学科学院毒物药物研究所纳米药理毒理学重点实验室，北京100850)

纳米活性炭，纳米二氧化硅和纳米二氧化钛对人胃肿瘤BGC-823细胞的毒性作用

曲秋莲，张英鸽

(军事医学科学院毒物药物研究所纳米药理毒理学重点实验室，北京100850)

目的探讨不同化学组成的纳米颗粒对人胃癌BGC-823细胞的毒性作用及其机制。方法分别以纳米活性炭(ACNP)、纳米二氧化硅(SiO2)和纳米二氧化钛(TiO2)100，200，400，800和1600 mg·L－1悬液作用BGC-823细胞24，48和72 h，MTT法检测细胞增殖，比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。ACNP 100 mg·L－1，纳米SiO2200 mg·L－1，纳米TiO2200 mg·L－1作用BGC-823细胞24 h，透射电镜观察细胞形态及超微结构的影响。纳米SiO2和纳米TiO2100，200，400 mg·L－1作用细胞24 h后，AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。ACNP、纳米SiO2和纳米TiO2100，200 mg·L－1作用细胞48 h后，用PI染色法检测细胞周期。结果ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2均能明显抑制BGC-823细胞的增殖，作用72 h后的IC50分别为874.2，676.2和883.5 mg·L－1。与正常对照组相比，纳米SiO2100～800 mg·L－1组LDH漏出量均显著升高，并呈浓度依赖性(r=0.9751，P＜0.01)，而纳米TiO2100 mg·L－1作用细胞24 h，LDH漏出量与对照组相比没有显著差异，但随着作用浓度增加和作用时间延长，各组LDH漏出量明显高于对照组(P＜0.05)。ACNP 100 mg·L－1作用24 h后，细胞出现细胞质浓缩、细胞核固缩和裂解。纳米SiO2200 mg·L－1和纳米TiO2200 mg·L－1作用24 h后均出现细胞坏死。纳米颗粒ACNP，SiO2和TiO2作用组均可见纳米颗粒进入细胞及线粒体损伤。纳米SiO2100 mg·L－1和纳米TiO2100 mg·L－1作用24 h，细胞坏死率与正常对照组(4.59±1.20)%相比显著升高(P＜0.01)，分别为(39.40±1.72)%和(14.12±0.90)%(P＜0.05);细胞凋亡率与对照组相比没有显著差异。ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2100和200 mg·L－1作用细胞48 h后，S期细胞增多，G0/G1期细胞减少，细胞碎片增多; ACNP组亚二倍体细胞增多。结论ACNP、纳米SiO2和纳米TiO2能够抑制BGC-823细胞的增殖。ACNP可诱导细胞凋亡。纳米SiO2和纳米TiO2能损伤细胞膜，造成以细胞坏死为主的毒性损伤。

纳米复合物;炭;二氧化硅;二氧化钛;胃肿瘤;细胞系，肿瘤;细胞毒性;细胞凋亡

纳米颗粒所具有的量子尺寸效应、小尺寸效应、表面与界面效应以及协同效应等使其展现出许多特有的性质，如比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、吸附能力强、催化活性强、毒性低及不易被体内和细胞内各种酶降解等［1］。近年研究表明，纳米颗粒是一种良好的药物或基因载体［2－4］。一些研究报道了无机纳米颗粒能够抑制癌细胞生长，如二氧化钛(TiO2)纳米粒子可抑制癌细胞增殖［5－6］，羟基磷灰石纳米粒子可导致癌细胞死亡［7－9］，这为无机纳米颗粒作为新型的抗癌药物提供了新的思路。

纳米活性炭(activated charcoal nanoparticles，ACNP)是很好的淋巴示踪剂及淋巴靶向药物载体［10－12］。研究表明，ACNP能抑制人胃癌BGC-823细胞的增殖，诱导细胞凋亡［13］。本研究采用同一粒径范围且形状相似而化学组成不同的ACNP、纳米SiO2和纳米TiO2，探讨不同化学组成的纳米颗粒在细胞毒性作用上的共性与个性问题。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂及仪器

人胃癌BGC-823细胞(北京协和医科大学基础医学细胞中心);DMEM培养基及胎牛血清(Gibco公司);噻唑蓝(MTT)(Amresco公司);二甲亚砜(DMSO)(Acros公司);乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司);AnnexinⅤ细胞凋亡检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司);核糖核酸酶(RNase A)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(Sigma公司);ACNP由本实验室自制，球状颗粒，平均粒径为(34±6)nm (¯x±s);纳米SiO2、纳米TiO2(杭州万景新材料有限公司)，纳米SiO2是平均粒径(30±5)nm的球状颗粒，纳米TiO2是平均粒径(20±5)nm的近球状颗粒;其余试剂均为国产分析纯;7020型全自动生化分析仪(日本日立公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);CM120型透射电镜(荷兰Philips公司)。

1.2 细胞培养

BGC-823细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养，每3 d按照1∶3比例传代。

1.3 细胞增殖及细胞膜完整性的测定

1.3.1 细胞分组

取对数生长期BGC-823细胞，按5×107L－1的细胞密度接种于96孔板，24 h后加入用DMEM培养液配制的纳米颗粒混悬液。ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2作用浓度均为100，200，400，800，1600 mg·L－1;对照组加培养液，每组设6个复孔。

1.3.2 MTT法检测细胞抑制率

上述各分组处理的细胞作用24，48，72 h后每孔加入MTT 500 mg·L－1，37℃孵育4 h后弃上清液，加DMSO 240 μl/孔，振荡10 min后用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度值(A)，计算细胞抑制率。抑制率(%)=(1－A实验组/A对照组)×100%。并用Bliss法计算IC50。

1.3.3 比色法检测LDH漏出量

上述各分组处理的细胞作用24，48，72 h后吸出培养液，以3 000×g离心10 min，取上清液500 μl，按LDH试剂盒使用说明进行操作，用全自动生化仪在340 nm波长处检测漏出在培养液中的LDH活性。

1.4 透射电镜观察细胞形态及细胞超微结构

将细胞接种于培养瓶中，于指数生长期加入纳米颗粒混悬液。根据1.3实验结果确定浓度: ACNP 100 mg·L－1，纳米SiO2200 mg·L－1，纳米TiO2200 mg·L－1;对照组加培养液。作用24 h后收集细胞，经离心、固定、脱水、浸透、包埋、超薄切片、铀铅染色，透射电镜观察并拍照。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

收集培养瓶内经纳米SiO2100，200和400 mg·L－1，纳米TiO2100，200和400 mg·L－1作用24 h后的细胞和对照细胞，按检测试剂盒说明书进行AnnexinⅤ-FITC和PI染色，流式细胞仪检测，用CellQuest Pro软件分析细胞凋亡率、坏死率及存活率。

1.6 PI染色法检测细胞周期

收集经ACNP 100和200 mg·L－1，纳米SiO2100和200 mg·L－1，纳米TiO2100和200 mg·L－1作用48 h后的细胞和对照细胞，4℃PBS洗2次，用预冷(－20℃)的70%乙醇在4℃下固定过夜后，4℃PBS洗2次，用0.2 ml PBS重悬细胞，加入RNase A 50 mg·L－1，37℃孵育30 min，加入PI 50 mg·L－1避光染色30 min，流式细胞仪检测(激发波长488 nm)，用ModFit LT细胞周期分析软件分析各细胞周期及亚二倍体细胞比例。

1.7 统计学分析

实验结果定量资料数据用¯x±s表示，用SPSS11.0软件进行统计分析。对A值和LDH酶活浓度采用具有一个重复测量的两因素设计的方差分析，组间比较采用Tukey HSD法检验;对细胞存活率、凋亡率、坏死率和细胞周期采用单因素方差分析，用LSD法进行组间比较。

2 结果

2.1 ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2对BGC-823细胞增殖的影响

ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2对BGC-823细胞均有不同程度的抑制作用，随着纳米颗粒的浓度增大和作用时间延长，细胞抑制率增加(图1)。ACNP作用48和72 h后的IC50分别为1182.7和874.2 mg·L－1;纳米SiO2作用24，48和72 h后的IC50分别为1261.5，953.4和676.2 mg·L－1;纳米TiO2作用72 h后的IC50为883.5 mg·L－1。3种纳米颗粒对BGC-823细胞毒性为:纳米SiO2＞ACNP＞纳米TiO2。

2.2 纳米SiO2和纳米TiO2对BGC-823细胞LDH漏出量的影响

表1结果显示，纳米SiO2组LDH漏出量均显著高于对照组，在100～800 mg·L－1浓度范围内呈剂量依赖性(r=0.9751，P=0.001)。纳米TiO2100 mg·L－1作用24 h，LDH漏出量与对照组相比没有显著差异;随着作用浓度的增加和作用时间的延长，各组LDH漏出量高于对照组(P＜0.05)(表2)。

图1 纳米活性炭(ACNP)、纳米SiO2和纳米TiO2对BGC-823细胞增殖的抑制作用.A:ACNP;B:纳米SiO2;C.纳米TiO2.细胞增殖抑制率(%)=(1－A实验组/A对照组)×100%.Fig.1Inhibitory effects of activated charcoal nanoparticles(ACNP)，nano-SiO2and nano-TiO2on BGC-823 proliferation.

表1 纳米SiO2对BGC-823细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响Tab.1Effect of nano-SiO2on lactate dehydrogenase (LDH)leakages in BGC-823 cells

2.3 ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2对BGC-823细胞形态及超微结构的影响

对照组细胞核膜完整，核内常染色质均匀分散;细胞质内游离核糖体丰富，可见少量线粒体和粗面内质网(图2A和图2B)。经ACNP 100 mg·L－1作用24 h后的细胞可见线粒体损伤，ACNP通过细胞膜进入细胞，进而进入细胞核及细胞凋亡等现象(图2C和图2D)。纳米SiO2200 mg·L－1作用24 h后，SiO2纳米颗粒进入细胞并滞留在细胞质内，形成较多团聚体，有的部分团聚明显，密度明显增高，这是细胞吞噬异物后的浓缩现象;可见细胞伸出伪足，将SiO2纳米颗粒分割、包围，进行吞噬;细胞间尚未被吞噬进入细胞的SiO2纳米颗粒呈球状，成片分布(图2E和图2F);细胞质内可见滑面膜同心圆小体，周围有肿胀的线粒体(图2E);坏死细胞核浓缩，核膜消失，细胞质结构不清(图2F)。纳米TiO2200 mg·L－1作用24 h后，TiO2纳米颗粒进入细胞并在细胞质内形成较多团聚体，部分团聚明显，密度明显增高;细胞质中线粒体嵴肿胀变空，基质电子密度大(图2G和图2H);可见TiO2纳米颗粒进入细胞核(图2G);坏死细胞胞膜破裂，内容物外溢，核膜破裂，核溶解(图2H)。

2.4 纳米SiO2和纳米TiO2对BGC-823细胞凋亡率和坏死率的影响

图3和表3结果显示，纳米SiO2和纳米TiO2作用细胞24 h后坏死率高于对照组(P＜0.05);但凋亡率与对照组相比没有显著差异。

2.5 ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2对BGC-823细胞周期的影响

表4结果所示，经ACNP 100，200 mg·L－1作用48 h后，细胞被明显阻滞在S期，G0/G1期细胞明显减少，亚二倍体细胞及细胞碎片增多。纳米SiO2100和200 mg·L－1及纳米TiO2100和200 mg·L－1作用48 h后，S期细胞增多，G0/G1期细胞减少，细胞碎片比例高于对照组。

表2 纳米TiO2对BGC-823细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响Tab.2Effect of nano-TiO2on lactate dehydrogenase (LDH)leakages in BGC-823 cells

图2 透射电镜下ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2作用24 h BGC-823细胞形态(×6300).A，B:对照;C，D:ACNP 100 mg·L－1;E，F:纳米SiO2200 mg·L－1;G，H:纳米TiO2200 mg·L－1.Fig.2Morphorological changes in BGC-823 cells treated with ACNP，nano-SiO2and nano-TiO2for 24 h by transmission electron microscopy.

表3 纳米SiO2和纳米TiO2作用24 h对BGC-823细胞存活率，凋亡率和坏死率的影响Tab.3Effects of nano-SiO2and nano-TiO2on survival rates，apoptotic rates and necrotic rates of BGC-823 cells for 24 h

3 讨论

本研究中的ACNP、纳米SiO2和纳米TiO2均为粒径在20～50 nm范围的球状或近球状颗粒，但三者的化学组成不同。活性炭化学性质不活泼，但当宏观物质缩小粒径成为纳米颗粒后，随着比表面积增加，表面原子数增多，表面能增高，颗粒的化学活性发生了改变，这可能使得其生物活性增强。纳米SiO2颗粒表面活性很高，可以产生Si和SiO自由基，这些自由基在含水介质中与金属离子作用可产生高度反应性自由基［14］。纳米TiO2作为一种常见的光催化纳米材料，能够通过产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)攻击有机物［15］。在本研究结果显示，ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2能够抑制BGC-823细胞的增殖。在以往研究中，ACNP 100和200 mg·L－1组LDH漏出量和细胞坏死率与对照组相比没有显著差异，但细胞凋亡率高于对照组［13］。这些结果表明，ACNP在作用浓度较低时不会使细胞膜的完整性遭到破坏，而形态学及流式细胞术均证实该浓度的ACNP能诱导细胞凋亡，这提示ACNP诱导BGC-823细胞死亡的主要途径可能是凋亡。纳米SiO2和纳米TiO2使培养上清液LDH活性增高，表明这两种纳米颗粒能破坏细胞膜的完整性，引起细胞坏死。细胞形态学研究结果表明，纳米SiO2和纳米TiO2组细胞呈现坏死特征的形态学改变，坏死细胞核溶解，核膜及细胞膜破裂，细胞质结构不清。因此推测纳米SiO2可以诱导细胞氧化损伤，使其膜性结构通透性增加，细胞内容物(包括细胞内酶)漏出至膜外，造成细胞坏死。纳米TiO2可能通过产生ROS，引起膜脂质过氧化，破坏细胞膜完整性。此外，ACNP，纳米SiO2和纳米TiO2均能引起线粒体损伤，表现为线粒体肿胀、基质电子密度增大;3种纳米颗粒均可进入细胞。肿瘤细胞有较强的吞噬能力，在纳米SiO2和纳米TiO2组可见纳米颗粒被吞噬进入细胞。纳米颗粒进入细胞后，在细胞质中形成团聚体，周围的细胞质有自行溶解、内质网扩张、线粒体肿胀等一系列损伤表现。文献报道，纳米颗粒还可以通过非吞噬机制穿过完整的细胞膜被细胞摄取［16］。在ACNP组，未见到明显吞噬现象，ACNP可能直接穿过细胞膜进入细胞内发挥作用。此外，在ACNP组和纳米TiO2组，可见纳米颗粒进入细胞核。核膜上有核孔，核孔直径为50～80 nm［17］，核质与胞质间的物质交换要通过核膜及核孔。推测ACNP和纳米TiO2可能经核孔进入细胞核。流式细胞术检测结果表明，纳米SiO2和纳米TiO2组细胞坏死率明显增高，而凋亡率与对照组相比没有显著差异。综合上述研究结果，纳米SiO2和纳米TiO2与ACNP的不同之处在于纳米SiO2和纳米TiO2所致BGC-823细胞死亡的主要方式是细胞坏死。细胞周期检测结果表明，ACNP、纳米SiO2和纳米TiO2均能将BGC-823细胞周期阻滞在S期，但ACNP的S期阻滞作用更为明显。ACNP可能通过S期阻滞，阻断肿瘤细胞的有丝分裂，并进一步诱导细胞凋亡。而纳米SiO2和纳米TiO2虽然也有一定程度的S期阻滞作用，但破坏细胞膜完整性，导致细胞坏死是其细胞毒性的主要表现。

化学组成或化学性质不同的纳米颗粒对细胞的毒性作用既有共性又有其各自的特点，表现出鲜明的个性。其共性表现在由于纳米颗粒的粒径非常小，可通过细胞膜进入细胞，甚至可以进入细胞核内，然后与肿瘤细胞中的某些组分发生作用，从而对肿瘤细胞产生抑制和调节作用。但是，纳米颗粒进入细胞的形式并不仅局限于被细胞通过胞饮和吞噬所摄取，部分纳米颗粒可直接穿过细胞膜进入细胞内发挥作用。此外，除了颗粒大小、形状、比表面积、物理性质外，化学性质对颗粒毒性也有重要影响。纳米颗粒进入细胞的过程及引起细胞凋亡或坏死的具体机制有待进一步研究。

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Cytotoxic effects of activated carbon nanoparticles，silicon dioxide nanoparticles and titanium dioxide nanoparticles on human gastric carcinoma cell line BGC-823

QU Qiu-lian，ZHANG Ying-ge
(Key Laboratory of Nanopharmacology and Nanotoxicology，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China)

OBJECTIVETo explore cytotoxic effects of activated carbon nanoparticles (ACNP)，silicon dioxide nanoparticles(nano-SiO2)and titanium dioxide nanoparticles(nano-TiO2)on the human gastric carcinoma cell line BGC-823.METHODSBGC-823 cells were exposed to ACNP，nano-SiO2and nano-TiO2100，200，400，800 and 1600 mg·L－1for 24，48 and 72 h.The inhibitory rate was observed by MTT assay.The lactate dehydrogenase(LDH)leakages in the culture medium were determined.The morphological changes were observed by transmission electron microscopy after cells were treated with ACNP 100 mg·L－1，nano-SiO2200 mg·L－1or nano-TiO2200 mg·L－1for 24 h.The apoptotic rate was detected by AnnexinⅤ-FITC/PI staining with flow cytometry after cells were treated with nano-SiO2or nano-TiO2100，200，400 mg·L－1for 24 h.The cell cycle was detected by PI staining after cells treated with ACNP or nano-SiO2or nano-TiO2100 and 200 mg·L－1for 48 h were collected.RESULTSACNP，nano-SiO2and nano-TiO2significantly inhibited the proliferation of BGC-823 cells.The 50%inhibitory concentrations of ACNP，nano-SiO2and nano-TiO2after 72 h were 874.2，676.2 and 883.5 mg·L－1，respectively.The LDH leakages in nano-SiO2100－800 mg·L－1groups significantly increased in a concentrationdependent manner(r=0.9751，P＜0.01).The LDH leakage of nano-TiO2100 mg·L－1was not higher than that in normal control group.The LDH leakage in nano-TiO2groups increased with the concentration and time.Condensation of the cytoplasm，condensation and fragmentation of the nuclear chromatin were observed in ACNP 100 mg·L－1for 24 h.The cells treated with nano-SiO2or nano-TiO2200 mg·L－1for 24 h exhibited necrosis.Mitochondrial damage was observed in the cells treated with ACNP，nano-SiO2or nano-TiO2.The necrotic rate of nano-SiO2and nano-TiO2100 mg·L－1was(39.40±1.72)%and(14.12±0.90)%，respectively，which were significantly higher than that of the control group(4.59±1.20)%(P＜0.05).The percentage of cells at S phase of ACNP，nano-SiO2and nano-TiO2100 and 200 mg·L－1groups was higher than that in control group，while the percentage of G0/G1-phase cells decreased.The percentage of"sub-G1"cells significantly increased in ACNP groups.CONCLUSIONACNP，nano-SiO2and nano-TiO2could inhibit proliferation of BGC-823 cells in vitro.ACNP could induce apoptosis of BGC-823 cells.Nano-SiO2and nano-TiO2could directly induce necrosis of BGC-823 cells by disintegrating plasma membrane.

nanocomposites;charcoal;silicon dioxide;titanium dioxide;stomach neoplasma; cell line，tumor;cytotoxicity;apoptosis

The project supported by National Basic Research Program of China(2006CB705602-7)，National Basic Research Program of China(2006CB933304)，National Basic Research Program of China(2010CB933904);National High Technology Research and Development Program of China(2007AA021803)

ZHANG Ying-ge，E-mail:zhangyg@126.com，Tel:(010)66930654

R99，R735

A

1000-3002(2010)06-0481-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2010.06.007

2010-06-22接受日期:2010-11-05)

(本文编辑:乔虹)

国家重点基础研究发展计划资助项目(2006CB705602-7);国家重点基础研究发展计划资助项目(2006CB933304);国家重点基础研究发展计划资助项目(2010CB933904);国家高技术研究发展计划资助项目(2007AA021803)

曲秋莲(1973－)，女，助理研究员，博士，主要从事纳米毒理药理学研究。张英鸽(1958－)，男，研究员，博士，主要从事纳米药理毒理研究。

张英鸽，E-mail:zhangyg@126.com，Tel: (010)66930654