香豆素类荧光探针在检测方面的研究进展

刘江张小琴韩隽刘俊彪黄锋马彬彬王宇光

（1.浙江工业大学生物与环境学院,浙江 杭州310011；2.江苏七洲绿色化工股份有限公司,江苏 张家港215600）

分析测试

香豆素类荧光探针在检测方面的研究进展

刘江1张小琴1韩隽2刘俊彪2黄锋1马彬彬1王宇光1

（1.浙江工业大学生物与环境学院,浙江 杭州310011；2.江苏七洲绿色化工股份有限公司,江苏 张家港215600）

香豆素类衍生物具有很好的荧光性能，所以香豆素类荧光探针的开发利用受到越来越广泛的关注，如单胺氧化酶、过氧化氢、β-内酰胺酶基因等荧光探针。

香豆素；荧光探针；单胺氧化酶

0 前言

荧光探针指的是一类在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质（激发和发射波长、强度、寿命、偏振等）可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的荧光性分子。荧光探针的优点有很多，比如说它有很高的灵敏度和选择专一性，反应时间短，样品不需要复杂的提纯，不具有破坏性等等[1]，在分析化学，特别是在生物分析中有较广泛的应用[2-4]。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测灵敏度较差，人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质，使检出限大大降低,这就是荧光探针技术。荧光探针的作用有很多，最常用于荧光免疫法中标记抗原或抗体，亦可用于表面活性剂胶束、双分子膜、多种离子，蛋白质活性位点等微环境特性的探测[5-8]。尤其近年来发展起来的荧光化学传感器和分子信号系统的应用已深入到药物学、生理学、环境科学、信息科学等多个领域。目前用于标记或衍生的荧光探针主要有香豆素类、罗丹明类、邻苯二甲醛类等化合物。

香豆素及其生物应用于染料、医药、香料和农药的文献已有很多的报道，不过香豆素类衍生物在荧光探针方面的报道在国内还不多见[9-11]。香豆素类化合物是一种具有强烈荧光的化合物，通过内酯结构使二苯乙烯化合物中双键被同定为反式，使得双键的旋转被阻抑起来，提高其光稳定性，从而使得原来荧光量子效率较低的二苯乙烯化合物转变为量子效率较高的香豆素化合物，避免了二苯乙烯化合物在紫外光照射下顺/反式的相互转化[12-15]。香豆素类衍生物具有很高的光量子稳定性及光致发光量子效率，因此在国外被广泛应用于荧光探针的检测。

1 香豆素类单胺氧化酶（MAO）的荧光探针

单胺氧化酶（Monoamine oxidase,MAO）是机体内参与胺类物质代谢的主要酶类，位于线粒体外膜质，分为MAO-A和MAO-B两种类型。单胺类物质在机体内具有重要的生理功能，单胺氧化酶的活性异常可引起机体多种功能障碍，形成疾病状态，如帕金森氏病、老年痴呆症及近年来都市中较为流行的抑郁症等均与MAO活性异常有关[16-18]。2004年Chen等[19]对香豆素类衍生物进行了改进，合成了具有检测MAO生物活性的荧光探针，机理见Scheme 1。他们合成了1，3，5探针，发现在MAO的作用下都生成了具有荧光性质的化合物2，4，6（Scheme 2）。

2008年陆优优等[20]利用香豆素衍生物设计了又一种简便有效的MAO探针，首先引入侧链基团使得香豆素的荧光猝灭 （Scheme 3），然后在MAO的作用下，该侧链基团脱掉，使得原来被猝灭的荧光又恢复。该探针设计简便，容易操作，因而被广泛应用于单胺氧化酶的检测。

2 香豆素类β-内酰胺酶基因探针

β-内酰胺酶是细菌体内酶系的一种，他对于盘尼西林以及其它的内酰胺类抗生素具有很高的催化效率，可以给予细菌对于该类药物的抗药性，那么对于该类基因是否在于细菌体内表达，Gao Wenzhong等[21]利用香豆素类衍生物设计了如下探针（Scheme 4），首先合成探针CC1和CC2，如果细菌体内该基因表达了β-内酰胺酶，那么β-内酰胺酶就会使得与香豆素相连的侧连基团断裂，这时就会有很强的荧光产生。通过荧光的产生与否就能判断该细菌体内的β-内酰胺酶基因是否表达。

3 香豆素类过氧化氢荧光探针

过氧化氢是一个重要的活性氧（ROS）因子，存在活的生物体的器官中，其稳态可以有不同的生理和病理的结果，过氧化氢和其他活性氧氧化剂之间的平衡与许多疾病有关病比如癌症心血管的混乱和阿尔茨海默氏症及相关的神经退行性疾病。另一方面，有新的证据显示过氧化氢可能在细胞信号转换过程中作为第二信使。Nobuaki Soh等[22]设计了香豆素类的H2O2探针DPPEA-HC(Scheme 5)，该探针受其它活性氧因子干扰少，专一性强，准确度高。

Albers A E等[23]设计了香豆素类H2O2的FRET（能量共振转移）探针（Scheme 6），该探针利用能量共振转移的原理，当环境中H2O2不存时，这是观察到的是香豆素结构的发射波长。如果环境中有H2O2存在下，使得两个荧光基团可以相互的靠近，能量发生转移，香豆素结构的发射波长正好被荧光素基团吸收，荧光素基团再发出一个发射波长，由于光子经过多次转移能量变弱波长变长，使得能观察到的激发波长和发射波长位置相距更远，更容易被检测，不容易引起计算的偏差，同时该探针还具有很好的选择性。

Du Lu-pei等[24]利用Click修饰设计了香豆素类H2O2探针 （Scheme 7），该探针巧妙的利用了Click反应修饰了香豆素基团，使其荧光强度更强，并且使其激发波长增加了70 nm，大大增加了Stoke位移，更加有利于观察和检测，准确度更高。该探针同样具有很好的选择性，且合成材料相对便宜，方法相对简单，有很好的应用价值。

4 香豆素类的CN离子探针

氰化物在有机合成中是非常有用的试剂。常用来在分子中引入一个氰基，生成有机氰化物，即腈。例如纺织品中常见的腈纶，它的化学名称是聚丙烯腈。腈通过水解可以生成羧酸；通过还原可以生成胺等，还可以衍生出其它许多的官能团来。

氰化物拥有令人生畏的毒性，其毒性跟CN离子对重金属离子的超强络合能力有关。CN离子主要跟细胞色素P450中的金属离子结合，从而使其失去在呼吸链中起到的传递电子能力，进而使中毒者死亡。氰化物中毒一般都很迅速。临床上常用的抢救方法是用硫代硫酸钠溶液进行静脉注射，同时使那些尚有意识的病人吸入亚硝酸异戊酯进行血管扩张来克服缺氧。常见的氰化物中毒原因是误食含氰果仁，比如生桃仁等。Kim Gun-Joong等[25]设计了香豆素类的CN离子探针 （Scheme 8），该探针对CN离子有很好的选择性，且其检测最低浓度约为3.0 μmol/L。利用该探针几乎可以通过肉眼来判别是否有CN离子的存在，因为当环境中有CN离子存在时，该探针的颜色会从淡淡的橘黄色(1)变成粉色(2)。

5 总结

随着香豆素类化学、合成化学、分子生物学、分子药理学的发展，可望有更多的香豆素类探针的开发和应用，寻找有效的专一性强的低毒的香豆素类探针已成为疾病监测和药物开发的新方向。

[1]Bosch P,Catalina F,Corrales T,et al.Fluorescent probes for sensing processes in polymers [J].Chem.Eur.J., 2005,11:4314-4325.

[2]张华山，王红，赵媛媛.分子探针与检测试剂[M].北京：科学出版社，2002.32l.

[3]葛凤燕，闫喜龙，潘惠英，等.荧光素类探针在生物分析中的研究进展[J].分析化学，2005,33(8):1199-1204.

[4]张传智，蒋春霞，王旭，等.含香豆素功能基聚合物的合成及荧光性能[J].高分子材料科学与工程，2007,23(6):85-88.

[5]Hirano T,Kikuchi K,Urano Y,et al.Improvement and biological applications of fluorescent probes for zinc,ZnAFs[J]. J.Am.Chem.Soc.,2002,124:6555-6562.

[6]Pearce D A,Jotterand N,Carrico I S,et al.Derivatives of 8-hydroxy-2-methylquinoline are powerful prototypes for zinc sensors in biological systems[J].J.Am.Chem.Soc.,2001, 123(21):5160-5161.

[7]Walkup G k,Burdette S C,Lippard S J,et al.A New cell-permeable fluorescent probe for Zn2+[J].J.Am.Chem.Soc., 2000,122(23):5644-5645.

[8]Adamczyk M,Chan C,Fino J,et al.Synthesis of 5-and 6-hydroxymethylfluorescein phosphoramidites [J].Org. Chem.,2000,65(2):596-601.

[9]邹坤，张如意，傅乃武.甘草属植物黄酮及香豆素类成分的抗氧化作用的研究 [J].实用医学进修杂志，1994,22(4): 208-211.

[10]杨劲松.抗HIV活性香豆素类化合物的研究进展[J].华西药学杂志，2001，16(4)：285-288.

[11]张巧艳，秦路平，黄宝康，等.蛇床子总香豆素对去卵巢大鼠骨质疏松症的作用 [J].中国药学杂志，2003，38(2): 101-103.

[12]樊美公,等.光化学基本原理与光子学材料科学[M].北京.科学出版礼.200l：32l.

[13]张彦英.荧光增白剂的剖析与方法研究[D].沈阳化工研究院硕士论文.1996：5.

[14]王心亮.新颖香豆素类荧光化合物的合成及其光谱性能研究[A].沈阳化工研究院硕士论文.2003：4.

[15]孙一峰，许炎妹，梁惠芬，等.香豆素类查尔酮化合物的合成及光学特性[J].中山大学学报(自然科学版)，2007,47 (2):55-58.

[16]顾牛范,李华芳.抑郁症药物治疗新进展 [J].中国临床药学杂志,2002,11(4):252-255.

[17]吴伟利,徐艳华.帕金森病治疗进展 [J].国外医学,老年医学分册,2002,23(9):236-238.

[18]王景田,杨赴云.单胺氧化酶抑制剂及其相互作用[J].中国药学杂志,2000,35(5):351-353.

[19]Chen G,Yee D J,Gubernator N G,et a1.Design of optical switches as metabolic indicators:new fluorogenic probes for monoamine oxidases(MAO A and B)[J].J.Am.Chem.Soc., 2005,127(13):4544-4545.

[20]Lu Y Y,Wang Y G,Dai B,et a1.A novel fluorogenic probe for monoamine oxidase assays[J].Chin.Chem. Lett.,2008,19:947-950.

[21]Wen Z G,BengangX,RogerY，etal.Novel fluorogenic substrates for imaging β-lactamase gene expression [J].J.Am.Chem.Soc.，2003,125：11146-11147.

[22]Nobuaki S,Osamu S,Koji M,et al.A FRET-based approach to ratiometric fluorescence detection of hydrogen peroxide[J].Bioorg.&Med.Chem.，2005，13:1131-1139.

[23]Albers A E,Okreglak V S,Chang C J,A FRET-based approach to ratiometric fluorescence detection of hydrogen peroxide [J].J.Am.Chem.Soc.,2006,128(30): 9640-9641.

[24]Du Lupei,N Nanting,L Minyong,et al.A fluorescent hydrogen peroxide probe based on a'Click'modified coumarin fluorophore[J].Tetrahedron Lett.,2010，51(8):1152-1154.

[25]Kim Gun-Joong,Kim Hae-Jo.Doubly activated coumarin as a colorimetric and fluorescent chemodosimeter for cyanide[J].Tetrahedron Lett.，2010，51(8):185-187.

Progress on the Coumarins Fluorescent Probe in Detection

LIU Jiang1,ZHANG Xiao-qin1,HAN Jun2,LIU Jun-biao2, HUANG Feng1，MA Bin-bin1,WANG Yu-guang1
(1.College of Biologial and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310011, China；2.Jiangsu Sevencontinent Green Chemical Co.,Ltd.,Zhangjiagang 215600,China)

Coumarins have higher fluorescence property and its exploitations in fluorescent probe have attracted more and more attention.They were widely applied on Monoamine oxidase,H2O2and β-Lactamase's gene detection.

coumarin;fluorescent probe;monoamine oxidase

1006-4184（2010）09-0027-05

2010-04-29

刘江（1986－），男，浙江江山人，在读硕士研究生，主要从事生物有机化学的研究。