RP-HPLC法测定柴胡中四种黄酮类成分的含量

岳志劲,关翠林,王海青,孟双明,郭 永

(山西大同大学化学与化工学院,山西大同037009)

RP-HPLC法测定柴胡中四种黄酮类成分的含量

岳志劲,关翠林,王海青,孟双明,郭 永

(山西大同大学化学与化工学院,山西大同037009)

建立反相高效液相色谱法测定柴胡中芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素四种黄酮类成分的含量.采用Shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)分离样品，以0.5%的磷酸溶液-甲醇(63:37)为流动相，流速为0.8 mL·min-1，检测波长333 nm，柱温40℃，进样量20 μL.结果显示柴胡中四种黄酮类药物达到了完全分离，线性范围1～10 μg，平均回收率在91.2%～96.3%之间，RSD分别为为1.6%，2.1%，3.0%和1.1%(n=3).

柴胡 芦丁 曲克芦丁 黄芩苷槲皮素 反相高效液相色谱

柴胡属伞形科植物，多年生草本，以根及全草入药，是我国大宗紧缺药材之一.它味苦、辛，性平，具有和解表里、舒肺解郁、升举阳气的功能，主治疏散退热、胸肋胀疼、月经不调等症[1].柴胡中的有效成分为柴胡皂苷、甾醇、挥发油(柴胡醇、丁香酚等)、脂肪油(油酸、亚麻油酸、棕榈酸、硬脂酸等)和多糖等，此外，还含有生物碱、黄酮类、山萘苷、葡萄糖、氨基酸等.其中黄酮类化合物对人体肿瘤、衰老、心血管等疾病的治疗和预防有重要意义[2].如芦丁具有抗氧化、抗基因突变，和降低毛细血管异常通透性及脆性的作用[3],临床上用于治疗过敏性紫癜及各种因毛细血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治疗高血压和老年气管炎等[4].曲克芦丁是芦丁在碱性条件下与环氧乙烷进行醚化反应得到的羟乙基芦丁的有效成分，能降低毛细血管的通透性和脆性，并有抑制血小板凝结，防止血栓形成的作用，是临床上治疗闭塞性脑血管病的常用药物[5].黄芩苷具有清热解毒，扩张心脑血管，改善体内微循环等作用[6].槲皮素是黄酮类化合物中具有代表性的一种,研究发现槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并发症等多种生物活性及药理作用，对呼吸道疾病，特别是对哮喘病和支气管疾病有较好的作用[7].

目前已报道的测定黄酮类药物的方法很多，主要有化学发光分析法[8]、毛细管电泳法[9]、高效液相

色谱法[10-11]、分光光度法[12]、等吸收紫外光度法[4]等，但一般都是分析一种或两种黄酮类成分，同时分析芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素四种成分还未见报道.本文采用反相高效液相色谱法，同时分离和测定了柴胡中芦丁、曲克芦丁、黄芩苷和槲皮素四种黄酮类成分的含量.操作方法简单易行，结果准确可靠，为柴胡中黄酮类成分的含量测定和质量监控提供了科学依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

日本岛津 (SHIMADZU)LC-10A高效液相色谱仪系统；CLASS-VP色谱工作站；Milli-Q纯水器(Millipore公司)；HANGPING SB2200电子天平 (上海天平仪器厂)；0.45 μm微孔过滤器；高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂).

芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100080-200306)；曲克芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100416-200503)；黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110715-200514)；槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406)；柴胡 (产地：河北祁州，生产厂家：河北安国兴旺制药饮片公司).甲醇、乙腈为色谱纯，水为Milli-Q纯水器处理的超纯水，其它试剂为分析纯.

1.2 实验方法与结果

1.2.1 对照品溶液的制备

称取芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素对照品各10 mg于四支比色管中,用甲醇溶解并定容至10mL，配制成浓度为1 mg·mL-1的标准溶液.取上述标准溶液各100 μL于一支10 mL比色管中，然后用甲醇定容至刻度，配制成浓度为0.01 mg·mL-1的标准混合溶液.测定时取上述标准溶液稀释成适宜浓度的标准溶液.

1.2.2 供试品溶液的制备

柴胡用粉碎机粉碎后，过4号筛，称取5 g置于圆底烧瓶中，加70 mL乙醇和30 mL水回流2.5 h.待冷却、过滤后，于78℃蒸馏回收乙醇.浸膏用水饱和的乙酸乙酯萃取3次(20:15:10)，合并乙酸乙酯层，于77℃蒸馏回收乙酸乙酯.残渣用甲醇定容至10 mL比色管中，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液再用0.45 μm微孔滤膜过滤即得.

1.2.3 色谱条件

色谱柱:Shim-pack VP-ODS柱 (150 mm×4.6mm，5 μm)；保护柱：Shim-packGVP-ODS柱(4.6 mm×10 mm，5 μm)；流动相：0.5%的磷酸溶液-甲醇 (63:37)；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：333 nm；进样量：20 μL；柱温：40℃.对照品和样品的色谱图见图1.

1.2.4 线性关系考察

取适宜浓度的标准溶液，用甲醇稀释并定容于10 mL比色管中，配制浓度分别为10 μg·mL-1，5μg·mL-1，2.5 μg·mL-1和1 μg·mL-14个水平黄酮类药物的标准混合液，每个溶液分别进样3次，以峰面积对浓度作工作曲线，用稀释法测定四种黄酮类药物的检出限.四种黄酮类药物的标准工作曲线线性范围、线性回归方程、相关系数、检出限列于表1，其中X表示黄酮类药物的浓度，Y表示黄酮类药物的峰面积.

图1 对照品(A)和柴胡药材(B)的高效液相色谱图

表1 四种黄酮类药物的回归分析结果及线性范围

1.2.5 稳定性试验

称取柴胡样品5 g，按1.1.2法操作制备供试品溶液，分别在1，2，3，4 d于上述色谱条件下测定，以峰面积计算芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素的RSD分别为2.1%，2.2%，3.5%，4.7%.结果显示供试品溶液在4 d内稳定.

1.2.6 重复性试验

称取柴胡样品5 g共6份，按1.1.2法操作制备供试品溶液，于上述色谱条件下测定，以峰面积计算芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素的RSD分别为1.1%，3.5%，2.7%，4.3%.

1.2.7 精密度考察

取上述对照品溶液20 μL，按照上述色谱条件重复进样6次，以峰面积计算芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素的RSD分别为1.6%，2.1%，3.0%，1.1%..

1.2.8 回收率测定

取已知含量的柴胡供试品溶液各1 mL分别于三支10 mL比色管中，再分别加入4 μL，6 μL，8μL的1 mg·mL-1芦丁、曲克芦丁、黄芩苷，(槲皮素因含量较高，标准品加入量增加10倍)，配制成4 μg·mL-1，6 μg·mL-1，8 μg·mL-1的加标溶液.在最佳色谱条件下进样，做加标回收试验，回收率见表2.

表2 柴胡中黄酮类药物的回收率(n=3)

1.2.9 样品测定

将柴胡供试品溶液直接进样分析，发现柴胡中槲皮素含量较高，故采用单点校正法定量，其它三种组分含量较低，采用标准加入法定量，样品测定结果见表3.

表3 样品中四种黄酮类成分含量测定(n=3)

2 讨论

2.1 流动相的选择

考察采用甲醇和水、甲醇和磷酸或磷酸盐、乙腈和磷酸、四氢呋喃(THF)和磷酸五种不同体系作为流动相时芦丁、曲克芦丁、黄芩苷、槲皮素四种黄酮成分的分离情况，结果表明：采用CH3OHKH2PO4(40:60)为流动相时，黄芩苷和槲皮素拖尾比较严重；选择H3PO4-CH3CN(54:46)为流动相时，各组分分离情况不佳；当用H3PO4-THF(67:33)为流动相时，虽然峰形比较好，但芦丁和曲克芦丁分不开；选择CH3OH-H2O(37:63)为流动相时柱压很高；而选用CH3OH-H3PO4(37:63)时，峰形好又可以使四个组分在35 min内达到完全分离，而且柱压也不高.综合考虑以上因素，最后选CH3OH-H3PO4(37: 63)为分离四种黄酮类药物的流动相.

2.2 流动相中甲醇比例的选择

考察流动相中甲醇比例不同时，对四种黄酮组分保留时间的影响.以混合标准溶液进样分析，结果显示：随着甲醇比例增加，流动相的极性增强，各组分的保留时间相应缩短.当甲醇比例超过37%时，各峰的峰形不太好；当甲醇的比例小于37%时，流动相极性减弱，各组分的保留时间相应增加，导致分析时间大大延长，且柱压增大；当甲醇比例为37%时，在35 min内四种组分达到基线分离.

2.3 检测波长的选择

取20 μL的0.01 mg·mL-1标准混合溶液进样，由紫外光谱可知：芦丁在350 nm和260 nm时有最大吸收；曲克芦丁在354 nm和255 nm时有最大吸收；黄芩苷在318 nm和274 nm处有最大吸收；槲皮素在370 nm和254 nm处有最大吸收.结果显示：当检测波长小于333 nm时，溶剂峰较大，干扰大，影响测定的灵敏度；当检测波长大于333 nm时，基线不稳且黄芩苷的灵敏度较低.而在333 nm时，四种组分均有较灵敏的响应，且干扰小，分离佳，便于检测，因此选择333 nm作为检测波长.

本方法重复性、精密度好，回收率符合要求，测定结果准确，可以为柴胡药材的质量监控提供实验依据.

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Abstract:To establish a method for determining Rutin,Troxerutin,Baicalin and Quercetin in Radixbupleurichinensis by RPHPLC.The analysis was performed on Shim-pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm,5 μm)column with mobile phase contained phosphoric acid (0.5%)-methanol(63:37).The flow rate was 0.8 mL·min-1 and the detection wavelength was set at 333 nm.The temperature of column was 40℃and the injected volume was 20 μL.Under this condition,Rutin,Troxerutin,Baicalin and Quercetin could be completely separated.The lined range of four flavonoids was 1～10 μg,respectively.The average recovery of four flavoniods was 91.2%～96.3%,and the relative standard deviations of the method were 1.6%,2.1%,3.0%and 1.1%(n=3),respectively.The method is fast,simple,accurate and reliable which can be applied to the quality control of Radixbupleurichinensis.

Key words:Radixbupleurichinensis；Rutin；Troxerutin；Baicalin；Quercetin；RP-HPLC

〔编辑 杨德兵〕

RP-HPLC Determination of Four Flavonoids in Radixbupleurichinensis

YUE Zhi-jin，GUAN Cui-lin，WANG Hai-qing，MENG Shuang-ming,GUO Yong
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi Datong University,Datong Shanxi,037009)

R284.2

A

1674-0874(2010)04-0035-04

2010-05-03

山西大同大学科学研究项目[2008k6]

岳志劲(1971-)，女，山西大同人，硕士，讲师，研究方向：分析化学.