ATM基因单核苷酸多态性与非小细胞肺癌易感性的研究

夏文进 苏丹 刘鹏 马胜林 姜志明 张毅敏*

1.浙江省中医药大学附属第三医院检验科，浙江 杭州 310003；2.浙江省肿瘤研究所，浙江 杭州 310022；3.浙江省肿瘤医院放疗科，*检验科，浙江 杭州 310022

毛细血管扩张性共济失调症突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）是导致毛细血管扩张性共济失调症（ataxia-telangi-angiectasia，AT）发生的致病基因［1］。在损伤修复通路中，它是DNA损伤位点识别因子，它能检测到损伤的DNA并激活一系列的修复反应。ATM蛋白属于PIK家族成员，离子辐射介导的DNA损伤是ATM激活的主要原因［2］。近年来，有许多研究［3-5］表明ATM基因的单核苷酸多态性会影响其功能，从而影响细胞对辐射的敏感性，与肿瘤的发生密切相关。但以往的研究主要集中在ATM与乳腺癌和前列腺癌的相关性，与NSCLC相关性的研究并不多见。因此，本研究主要探讨ATM基因单核苷酸多态性（rs664143，IVS62+60G＞A）是否与NSCLC的发生相关。

1 资料和方法

1.1 研究对象 2004年6月—2005年12月期间，从浙江省肿瘤医院共收集资料完整的264例NSCLC患者标本，另以264例健康体检者作为正常对照组。本研究通过医院伦理委员会讨论通过。两组资料在年龄、性别方面差异均无统计学意义，但病例组吸烟人数明显多于对照组，差异有统计学意义（表1）。

表1 NSCLC患者和正常对照的一般资料Tab.1 Information of patients with NSCLC and normal control n (%)

1.2 DNA收集及分型检测 每个患者提供治疗前外周血1 mL，用含有EDTA抗凝剂的真空管收集后放-80 ℃保存待用。Wizard®基因组DNA纯化试剂盒（美国Promega公司）用于分离DNA，提取过程按试剂盒说明操作。单核苷酸多态性检测采用Taqman探针基因分型技术，在ABI 7500适时定量PCR扩增仪上完成（AApp---plied Biosystems Inc.，Foster City，CA）。探针、引物和Taqman通用PCR混合液均购于美国ABI公司。PCR总反应体系为5 mL，混合有0.25 mL的引物和探针，2.5 mL PCR 反应液和5 ng DNA。PCR反应条件如下： 95 ℃预变性10 min，92 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，40个循环。每块板上加有2个无DNA空白标本，6个已知基因组DNA标本，2个随机重复的标本分别作为阴性对照，阳性对照和质量控制。7500扩增仪附带的随机软件SDS等位基因分型软件分析结果。

1.3 统计处理 不同人群中的基因型之间以及2种基因型之间的疗效对比均采用χ2检验，再以结局为应变量，基因型为自变量做非条件Logistic回归，以比值比（OR）及其95%可信区间表示2种基因型多态性与疗效的相关性。SPSS 11.0统计软件用于统计分析，并计算OR值及95%可信区间，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

ATM 单核苷酸多态性（IVS62+60G＞A）基因型分布在NSCLC病例组和正常对照组中有差异。在NSCLC病例组中，A/A基因型占32.6%，A/G基因型占52.6%，G/G基因型占14.8%。而正常对照组中相应的数值分别为26.0%、53.0%和21.0%。G/G基因型在NSCLC中所占的比例低于在正常人中的比例。Logistic回归分析显示携带有G/G基因型者肺癌发生的风险明显低于携带有A/A基因型者，危险系数是其的0.561倍（95%CI为0.334～0.942，P=0.029）；当排除混杂因素，如性别、年龄和吸烟状况等因素的干扰后，结果仍然有统计学意义，OR为0.569（95%CI为0.327～0.990，P=0.046，表2）。本研究中将ATM基因型吸烟和不吸烟患者及对照人群进行分层分析（表3），未发现ATM基因分组在吸烟情况中有统计学差异（Pearson χ2=7.27，P=0.269）。

表2 NSCLC患者和正常对照组ATM基因型的分布情况Tab.2 The ATM gene distribution in patients with NSCLC and control

表3 ATM基因型吸烟和不吸烟患者及对照人群中的分布情况Tab.3 Comparison of ATM gene distribution in control and patients about smoking status

3 讨 论

本研究发现A T M单核苷酸多态性（IVS62+60G＞A）基因型分布在NSCLC病例组和正常对照组中有差异。G/G基因型在NSCLC中所占的比例低于在正常人中的比例，携带有G/G基因型者肺癌发生的风险明显低于携带有A/A基因型者，H值比是0.561，G等位基因的纯合状态可能是NSCLC发生的保护性因素。该结果与Kim等［6］的结论相同。该研究同时检测了616对肺癌和健康人外周血中ATM基因多态性位点-518A＞G， IVS21-77C＞T，IVS61-55T＞C和IVS62+60G＞A，分析了它们与肺癌发生的相关性。结果显示只有IVS62+60G＞A与肺癌有相关性，其A位点基因较G位点基因患肺癌的危险性更高［6］。

在真核细胞中，各种因素（如代谢产物，紫外线、电离辐射等）会损伤细胞DNA。如果这些DNA损伤不能被修复，将导致基因的变异、染色体的缺失，影响细胞遗传信息的精确传递，最终导致肿瘤的发生。作为损伤识别因子，ATM主要检测电离辐射或紫外线导致的DNA损伤，从而被激活，并启动细胞DNA损伤反应的各种信号通路。各种基因通过使各种蛋白磷酸化来调节细胞周期和凋亡，如p53，mdm2和chk2基因，通过激活BRCA1，RAD50和NBS1等DNA修复基因启动修复通路［7-10］。ATM基因功能异常将影响DNA损伤修复通路，与肿瘤的发生密切相关。在该研究中ATM单核苷酸多态性位点（rs664143，IVS62+60G＞A）位于ATM基因第62个外显子的第60位核苷酸，生物信息学分析显示其可能位于蛋白结合区，其变异可能影响基因的剪切，导致不同剪切物的形成。基因型为ATM60G/G可能影响了ATM蛋白的表型，与基因型为A/A的个体相比，有更强的DNA修复能力，是发生NSCLC的保护性因素。今后，我们将进一步研究该位点的功能，为更好地阐述SNP在肿瘤易感性中所扮演的角色提供理论依据。

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［2］ Kastan MB, Lim DS, Kim ST, et al.ATM--a key determinant of multiple cellular responses to irradiation［J］.Acta Oncol,2001, 40(6)： 686-688.

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