SRY基因、SOX-9基因检测在性反转中的应用研究

邓国良 常大黎 朱峥燕 黄俊生

河南濮阳市妇幼保健院检验科（457000）

1990年，Sinclair等[1]在对XX男性性反转患者的研究中，首先发现了SRY基因，表明它在性腺发育中的作用，但是近年来发现有不少患者SRY基因阴性而表现为男性性反转。SRY基因编码的蛋白质有与DNA结合的模体，称为HMG盒，在HMG盒内与SRY产物具有60%以上的氨基酸序列相似性的编码基因命名为SOX（SRY Related HMG box genes）基因，其中SOX-9基因在软骨组织和性腺中表达，从而引起了人们对SOX-9的重视。SOX-9基因的突变或重复会导致躯干、性腺的发育异常。

1 对象与方法

1.1 对象

1995年以来在濮阳市妇幼保健院生殖中心就诊的患者，他们大多是以不孕不育来诊，共发现性反转患者5例，46，XX男性性反转4例，46，XY.t（10；13）（p10；q22）女性性反转1例其中1例46，XX男性性反转SRY基因阴性，SOX-9基因阳性，社会性别男性，阴茎短小，阴毛女性分布，尿道下裂，双侧乳房发育良好，形态似女性，激素检测为：雌二醇、孕酮正常，睾酮偏低、促卵泡生成素偏高。

1.2 方法

1.2.1 染色体核型分析

患者外周血2mL，肝素锂抗凝，18～24滴于 1640培养液中37℃培养68h，收获前1h15min加入秋水仙素，常规G显带分析，必要时加作C带，计数30个分裂相，核型分析系统分析3～5个核型。

1.2.2 选不同颜色的X染色体探针和SRY基因探针，杂交，共变性后，37℃过夜，洗涤，复染荧光显微镜下观察，从FISH结果看3例均检测到SRY基因，其中1例46，XX和1例46XY女性性反转未检出SRY基因，4例SRY基因均易位到X染色体上，4例46，XX性反转均未见Y染色体。

1.2.3 SOX-9基因的检测

采取患者2mL外周血TDTAK2抗凝，试剂：TapDNA聚合酶，SOX-9引物序列，SOX-9外显子引物F：5′-CAGGAGGGAAGATGG AGTTG-3′；R：5′-GCATAAAGTCCCCACGAAGA-3′片段长度为491bp，各管体积为50μL内有dNTP200μmol/L，扩增引物10pmol等，扩增条件为94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共循环30次，取扩增物10μL加2μL溴酚蓝混匀，电泳结果如图1。

图1 SOX-9基因电泳图

1.2.4 对其中的一例患者46，XX男性性反转SRY基因阴性，而SOX-9基因阳性进行了基因测序，与正常对照，并未发现异常。

2 讨 论

2.1 性反转综合征（sex reverse syndrcme）是染色体核型和性腺性别不一致的一类疾病，它包括46，XX男性性反转和46，XY女性性反转。46，XX男性综合征是一种少见的性反转疾病，男性新生儿发病率约为1∶20 000。患者表型多为男性，从这5例患者的外观，外生殖器及染色体核型分析看这5例均属于性反转，其中3例46，XX男性性反转，是由于SRY基因易位到X上所致，1例46，XY.t（10；13）（p10；q22）女性反转是缺失SRY基因所致。文献报道，在能够检测到的XX男性中，大约80%的病因可与父亲减数分裂过程中X和Y同源区域之间的不等交换有关，使带有SRY基因的 Y染色体片段易位到 X染色体短臂上，也有报道SRY基因易位到常染色体上。睾丸决定因子（Yp11.3 SRY testicular detemining factor，TDF的最佳候选基因定位于染色体上Y的基因，睾丸在原始性腺中的发育就是由它促使的，男性个体的表型由睾丸产生的激素决定，不管受精卵中有没有Y染色体只要缺乏SRY基因，胚胎的原始性腺就会向卵巢分化即胎儿发育成女性。SRY基因发生易位缺失或者突变都可能导致性腺发育异常，SRY基因具有表达的时间特异性和组织特异性，只在睾丸组织中表达。研究表明，SRY基因对男性性别起着开关控制的作用，这种开关控制是通过对其他基因表达的调节而形成的。

2.2 有很少一部分患者，在没有SRY基因的情况下，性腺也能发育，这就使人们想起SOX基因，SOX基因是SRY基因的 HMG编码区有较高的同源性的人类基因组中有几个保守的 SRY样基因 SRY-like gene，SOX-9基因是 SOX基因家族中一员，位于 17号染色体长臂，有报道即使没有 SRY基因，而有重复的 SOX-9或者SOX-9发生突变，从而使其表达增强也能导致睾丸分化，从而表现46，XX男性SRY阴性。但与SRY基因仅在哺乳动物发现不同，SOX-9在脊椎动物均可发现，似乎表明SOX-9是比SRY更古老的性别分化基因。Huang等[2]于1999年报道1例SRY基因阴性的46，XX，dup（17）（q23.1q24.3）/46，XX男性性反转患者，FISH证明在17号染色体上SOX-9基因出现重复拷贝说明在缺乏SRY的情况下，额外拷贝的SOX-9基因足以启动睾丸分化，本文所述病例基因测序并未发现突变很可能是SOX-9基因的重复所致。最近，Malki 等发现，前列腺素D（prostaglandin D，PGD）可诱导培养的正常大鼠雌性性腺表达SOX-9。由此可见，染色体异常及其他旁路激活（如PGD）介导的SOX-9基因表达上调可能导致SRY阴性的46，XX 男性发生。作为SRY 同源基因的SOX-9 基因，它的高表达与睾丸分化相关，SOX-9基因继 SRY表达后第1个在支持细胞前体细胞表达的基因。动物实验证实，在SRY基因不存在的时，SOX-9基因在未分化性腺的雌性小鼠中过度表达，就能引发Muller 管抑制物质Mis表达，使雄性生殖器官正常发育，性腺发育为睾丸。SOX-9在雌性性腺的异常表达与人类和动物的性反转相关。这表明有功能的Sertoli 细胞可以有过度表达的SOX-9基因支持细胞的前体细胞分化。做为 SRY分化的第1个分子标志物，Mis可促使移入未分化性腺中的Leydig 细胞前体细胞在Sertoli 细胞分泌因子作用下分化为Leydig细胞，分泌睾酮，促进雄性生殖管道正常发育。由此认为在SRY基因缺失的情况下SOX-9 可发挥作用。研究表明，对性别决定有影响的除SRY基因之外，X染色体或常染色体上的某些基因发生改变也可导致睾丸发育。也有研究表明，在正常男性的某个常染色体基因表达被SRY基因所抑制因而发育为男性，而正常女性发育时没有SRY抑制常染色体基因表达因而发育为女性，这一常染色体基因的表达失活也可造成无SRY XX的男性个体的发生。因此，性别决定是除SRY基因之外多基因参与的复杂过程。胚胎期正常性分化的结果实际上是看睾丸的分化，它的分化与否决定性别发育的方向。人类胚胎的正常性分化，包括确定3个性别：①性腺性别；②表型性别；③染色体性别。人类3种性别的划分与决定是以分子遗传学和细胞生物学为基础的极为复杂，彼此独立又密切相关的演变过程。每一次独立的性别分化阶段按严格规律循序渐进同时又受各阶段特异的因子的控制。第一阶段是染色体或遗传性别的确定，这个阶段有精卵结合所决定，第二阶段是在各种影响因子的影响下由染色体性别转变为性腺性别。第三阶段是表性性别的发育完成由外生殖器官和生殖管道完成而决定。在正常发育情况下，性腺性别、染色体性别和表型性别是一致的，在性分化的任何阶段中出现异常，上述3种情况均可出现不一致现象，从而引起多种程度不同的性分化异常疾病。人类3～5周胚胎的性腺还没有分化，具有分化卵巢和睾丸的两种潜力，约于精卵结合后第6周，在SRY基因和Y染色体的影响下，原始性腺分化为睾丸；而无SRY基因和Y染色体的 XX胚胎，原始性腺将于第13周自然发育成卵巢。Y染色体及SRY基因的存在决定了睾丸的发生，从而决定了性别的分化。而SRY基因与睾丸的发生密切相关。SRY基因编码一种含 204个氨基酸的核蛋白 SRY蛋白，它定位与Yp11. 32，在早期胚胎发育的性腺组织中有短暂表达，导致原始性腺组织向睾丸组织分化。SRY基因 HMG盒，能特异性地识别和结合核心序列为 5′- CCTTTGA - 3′的DNA片段，从而对其受控基因的编码进行调控。很明显，其间若发生碱基置换、基因突变、易位或缺失均可导致SRY蛋白失活，从而表现为46，XY女性性反转。由此可知，鉴定SRY基因存在与否为早期诊断性分化异常提供了依据。还有其他一些基因如 WT1、SOX-9、SF1、M IS、SIPs、XH2、DAX - 1、Wat家族等也与睾丸决定性别分化有关。

2.3 遗传模式与产前诊断

46，XX男性性反转90%与SRY 基因阳性有关的，并且常发生在X染色体上，若其 SRY 易位到常染色体，母亲表型正常不携带致病基因而其父亲表型正常但可能携带易感基因。若先证者SRY易位到X染色体，则其双亲表型正常也不携带致病基因；而其男性同胞中XY型者不受累而 XX型者受累概率＜1%；其中若父亲基因型为XY且有2套SRY分别易位到X染色体和常染色体，则先证者男性同胞中XY型个体不受累而XX型者将同时受累，出现46，XX真两性畸形或46，XX性反转。若 SRY易位到常染色体，则不增加先证者同胞受累概率；若同时先证者父亲的SRY基因也易位到常染色体，则XX基因型同胞中有50%可能SRY基因易位，出现46，XX真两性畸形或46，XX性反转。Abbas报道SRY易位到常染色体，生育能力不受影响，若SRY基因阳性的46，XX男性的SRY易位到X染色体，则无生育能力。对于SRY基因阴性的遗传还不清楚，可能是常染色体隐形遗传，其母亲或父亲必为正常的杂合子。其同胞1/2为携带致病基因，1/4可能受累，1/4完全正常，杂合子无异常症状[3]。产前诊断：当超声诊断和染色体核型分析不一致时，应当给与重视，看是否是性反转。避免性反转患儿的出生。从发生性反转的比例来看，性反转已经不是一个小数，但是得到早期诊断和治疗的，从报道看不过几百例，得到产前诊断的只有2例，我相信随着染色体 Giemsa染色显带技术的改进、聚合酶链反应PCR 技术和荧光原位杂交 FISH技术的广泛应用，及其人们产前诊断意识的增强，我们是可以做到早诊断、早治疗的。

2.4 治疗

早期发现社会性别和核型分析不一致是治疗的关键，娇治外生殖器官并给与激素治疗是诊治性反转患者的主要原则。对于SRY阳性的46，XX男性的患者，尽管其缺乏生精能力且外生殖器发育不良，但是间质细胞仍具有一定的内分泌功能，能形成男性的一些特征，及时检测内分泌，必要时在青春期给予雄性激素的治疗，以促进男性性征的发育，成年后可有性冲动和性生活，因此没有必要转换性别，重点在矫正外生殖器官的畸形，成年后尽管不能生育，给与激素治疗，以维持足够的性欲，提高生活质量。对于SRY阴性的46，XX男性患者多表现为性别难辨，治疗处理常须根据患者性心理及生理发育状况谨慎考虑，依靠激素维持第二性征可能无法避免。总之，性腺分化是多基因参与的过程，任何过程的变化均可有一定程度的表现改变，随着人们对性反转发病机理研究的不断深入，终将揭开它的面纱。

[1]Sinclair AH,Berta P,PalmerMS,et al.A gene from the human sexdetermining region cncodes aprotei with hemology to a conserved DNA-bingingmotif[J].Nature,1990,346(6281)：240-2442.

[2]HuangB,Wang S,Ning Y,et al.Autosomal XY sex rexersal caused by dup lication of SOX-9[J].Am J Med Genet,1999,87(4)：349-3533.

[3]柳林,逄力男,杨利丽.46,XX男性表型及遗传学研究进展[J].国外医学内分泌学分册,2005,25(4)：283-285.