猪弓形虫病血清流行病学调查与分析

刘靖清，张 亮，袁 涛

（1.盐城市畜牧兽医局，江苏盐城 224002；2.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046）

猪弓形虫病血清流行病学调查与分析

刘靖清1，张 亮2，袁 涛2

（1.盐城市畜牧兽医局，江苏盐城 224002；2.中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046）

弓形虫病是龚第弓形虫引起的一种人和多种动物共患寄生虫病。猪肉被认为是引起人感染弓形虫病的主要传染源，鉴于弓形虫病对养殖业造成巨大经济损失以及先天性弓形虫病对优生优育的重要影响和获得性弓形虫病对免疫功能低下病人的严重危害。应将该病的诊、治、防工作作为研究重点。

弓形虫这一病原体于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的啮齿类梳趾鼠体内发现，并正式命名。几乎同时，Splendole亦于1908年在巴西一个实验室的家兔体内发现了弓形虫。自此以后，陆续在世界各地的人和动物中发现弓形虫病。我国于20世纪50年代首先在福建的猫、兔等动物体发现了本病病原体，但直至1977年后才陆续在上海、北京等地发现过去所谓的“无名高热”是由弓形虫引起的，并引起普遍的重视。弓形虫病宿主种类十分广泛，和动物感染率都很高。据国外报道，人群的平均感染率25%～50%，有人推算全世约1/4的人感染弓形虫。在免疫缺陷和免疫抑制病人合并感染弓形虫可导致脑炎发生。猪暴发弓形虫病时，可使整个猪场发病，死亡率高达60%以上。其它家畜如牛、羊、马、犬和实验动物等也都能感染弓形虫。因此本病给人类健康和畜牧发展带来很大危害和威胁。目前各省市各种动物均有本病的存在。其特征表现为高热稽留，呼吸困难，皮肤发绀，流产，便秘或腹泻。临床可见急性、亚急性和慢性三种病型，严重的可引起死亡。是目前危害养殖业的一种重要的寄生虫性疾病，磺胺类药物对弓形虫有很好的疗效，临床上常用的磺胺六甲氧嘧啶、磺胺五甲氧嘧啶、复合磺胺嘧啶钠、强化长效抗菌剂、甲氧苄胺嘧啶（TMP）和磺胺甲氧吡嗪（SMP2）等都是很好的治疗药物。用药时要注意“用早药、疗程足”的治疗方针，病情控制后应继续治疗1～2 d，效果较好。

一、材料和方法

（一）材料

1.抗原。弓形虫间接血凝实验冻干抗原，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为20070718。用于检测人和动物血清或滤纸干血滴中的弓形虫抗体，效价不低于1∶1024。用前按标定毫升数用灭菌蒸馏水稀释摇匀，1 500～2 000 r/min离心5～10 min，弃去上清液，加等量稀释液（PDS与兔血清）摇匀，置4℃左右24 h后使用。稀释后作为诊断液，4℃左右保存，10 d内效价不变。

2.标准阳性和阴性血清。弓形虫标准阳性血清（效价不低于1∶1024），中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为20070718。弓形虫标准阴性血清，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为20070718。

3.被检血清。采自甘肃省11地区的定点屠宰场、养殖场、散养户等动物的血清534份。成年猪从耳静脉采血，每头动物采血3～5 ml。37℃静置0.5～1 h后（或2 000 r/min离心5 min）分离血清约1.5 m1，置-20℃备用。

4.稀释液。稀释液，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为20070718。

自配稀释液。先配制含0.1%迭氮钠的pH7.2, 0.15 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS），称取磷酸氢二钠19.34 g、磷酸二氢钾2.86 g、氯化钠4.25 g、迭氮钠1.00 g，双蒸馏水或无离子水溶解并加至1 000 ml，过滤后分装，10磅15 min高压灭菌。取含0.1%迭氮钠的PBS 98 ml、56℃灭活30 min的健康兔血清2 ml，混合，无菌分装，4℃保存备用。

5.病猪与病料。武威市某猪场饲养发病猪群；无菌采取病死猪肺门淋巴结、肺、肝、脾等脏器组织。

6.主要试剂。

（1）瑞氏染液。市售的瑞氏染色粉0.2 g，加无水中性甲醇100 ml，溶解后移入棕色小口试剂瓶中，加塞，置室温下，每日摇动45 min，一周后可用。

（2）姬氏染液。取市售姬氏染色粉0.5 g，中性纯甘油25.0 ml，无水中性甲醇25.0 ml。先将姬氏染色粉置研钵中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，直到甘油全部加完为止，将其倒入100 ml的小口试剂瓶中，在研钵中加少量的甲醇以冲洗甘油染液，冲洗液仍倾入上述瓶中，再加再洗再倾入，直到25 ml甲醇全部用完为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，而后将瓶置于65℃温箱中24 h或室温3～5 d，并不断摇动，即为原液。取原液2.0 ml，加到中性蒸馏水100 ml中，即为染液。

（3）血琼脂培养基。将灭菌的营养琼脂加热融化，冷至45℃～50℃，加入无菌鲜血达5%（即每100 ml营养琼脂中加入鲜血5～6 ml），分装于试管中，摆成斜面，或倾注于平皿，待凝固后，置37℃培养1～2 d，有污染者废弃，无菌者保存于冰箱备用。

（4）无菌鲜血。无菌手术法采取健康动物（通常是绵羊或家兔）血液，加入盛有无菌5%柠檬酸钠溶液的容器中（血与5%柠檬酸钠的比例约为9∶1），混匀，置冰箱中保存。

（5）青霉素、链霉素。购自华北制药厂。

7.主要仪器。微量移液器（25μ l,75 μ l, 1 000 μ l），微量血凝反应板（96孔），隔水式恒温培养箱，温度范围5℃～60℃，离心机4 000 r/min，超生波清洗器，微量搅拌器。

（二）方法

1.弓形虫病的血清学调查。采用弓形虫病间接血凝试验，对采自甘肃省11个地区的猪血清样品进行检测。取V型微量反应板，按以下步骤操作。

⑴加稀释液。用移液器将稀释液加入96孔V型反应板上，每孔0.075 ml。定性检查时，每个样品加4孔，定量则加8孔。每块板上均应设阳、阴性血清对照，对照均加8孔。

⑵加待检血清和阴、阳性对照血清，并作梯度稀释。第一孔加相应血清0.025 ml，混匀后取0.025 ml加入第二孔中，混匀后取0.025 ml加入第三孔中，以此类推。定性检查时稀释至第3孔后，取0.025 ml弃去，第4孔为稀释液对照；定量检查与对照均稀释至第7孔后，取0.025 ml弃去，第8孔为稀释液对照。

⑶加诊断液。每孔加诊断液0.025 ml，加完后将反应板置微型振荡器上震荡1～2 min，直到诊断液中的血球分布均匀。取下反应板，盖上一块玻璃板或干净纸，以防落入灰尘，置22～37℃，2～3 h后观察结果。

表1 甘肃省各地区猪弓形虫感染情况

表2 不同月龄猪弓形虫感染情况

表3 不同地区猪抗体滴度分布

⑷结果判定。阳性对照血清滴度不低于1∶1024（第5孔），阴性对照血清除第1孔允许存在前滞现象（＋），其余各孔均为（-），稀释液对照为（-）。依据判定标准对被检血清进行判定。(++++）：100%红细胞在孔底呈均质的膜样凝集，边缘整齐、致密（因动力关系，膜样凝集的红细胞有的出现下滑现象）；（+++）：75%红细胞在孔底呈膜样凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成很小的圆点；(++）：50%的红细胞在孔底呈稀疏的凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大的圆点；(+）：25%的红细胞在孔底凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成大的圆点；(-）：所有的红细胞均不凝集，并集中于孔底中央呈规则的最大的圆点。以被检血清抗体滴度达到或超过1:64判为阳性，判(++）为阳性终点。

二、结果

（一）猪弓形虫感染情况通过间接血凝试验调查了534头家畜血清抗体阳性55头（个），平均阳性率为10.29%.

（二）不同地区猪弓形虫感染情况通过间接血凝试验调查了11个地区的534头猪弓形虫感染情况，结果见表1。其中，血清抗体阳性55头，平均阳性率为10.29%。

（三）不同月龄的猪感染情况通过间接血凝试验分别对武威地区6～13个月龄猪弓形虫感染情况进行调查，结果见表2。其中，抗体阳性37头，平均阳性率11.07%。

（四）抗体滴度分布弓形虫血清抗体阳性的家畜中，猪抗体滴度最高达1∶1024。在55份阳性血清中，1∶64的有35份，占63.63%，1∶ 256的有16份，占29.09%，1∶1024有4份，占7.27%不同地区猪的抗体滴度分布情况见表3。

三、结论

1．调查表明，各地猪均有弓形虫感染，平均阳性率为10.29%

2．调查的55份阳性血清中，1∶256有 16份， 占 29.09%，1∶1024有4份，占7.27%，所以属急性感染者20份，占36.36%。

3.从猪弓形虫阳性检出率为10.29%来看，目前猪弓形虫病还比较严重，同时，确诊武威地区某养猪场育肥猪患有弓形虫病。

4.农户散养、个体饲养场以及小规模饲养场的猪弓形虫阳性率明显高于大规模饲养场，这主要与卫生条件、饲养水平、管理方式有关。不同月龄猪的弓形虫感染率没有明显的差异，也没有严格的季节性，但秋冬季和早春发病率高，可能与此时动物机体抵抗力较低有关。养猪场除了要做好灭鼠、驱猫工作外，还应防范饲料污染，特别是从农户收购饲料原料的场，要了解原料与猫的接触情况，以防止通过污染饲料渠道感染弓形虫。

（略）