发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取

朱 姁，潘道东,2,*

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取

朱 姁1，潘道东1,2,*

(1.南京师范大学 国家乳品加工技术研发分中心，江苏 南京 210097；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

确定提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的最佳方法和最佳提取条件。在单因素试验的基础上，采用多指标正交试验设计和综合平衡分析法研究溶菌酶结合非离子表面活性剂法提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的裂解液成分和提取条件。结果表明：裂解液的成分为50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、体积分数3%吐温-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9；提取条件为裂解液与菌体的比例10:1(V/m)、保温时间5h、保温温度37℃时酶比活力达38.957U/mg，此时可最大效率的获得发酵乳杆菌的细胞壁蛋白酶。

发酵乳杆菌；细胞壁蛋白酶；提取

据专家推测，2025年全世界将有超过15亿高血压患者。在高血压人群中有95%以上的患者属于原发性高血压，利用酶学或微生物发酵技术制备血管紧张素转移酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)抑制肽或制成相应的食品，且具有有效降低原发性高血压的效果，且相对于合成降压药更安全可靠、无副作用。研究发现一些乳酸菌在发酵过程中分泌的蛋白酶能分解乳蛋白产生多肽，对ACE具有抑制作用[1-3]。细胞壁蛋白酶(cellenvelope proteinase，CEP)是乳酸菌蛋白水解过程中的第一个酶，扮演了一个非常重要的角色，前人用纯化的CEP水解乳蛋白发现，CEP可以单独水解乳蛋白产生ACE抑制肽，所以，对于CEP的研究至关重要，但是现在国内外对CEP的研究主要是乳球菌类，乳杆菌类也仅限于瑞士乳杆菌，本实验将尝试从发酵乳杆菌中提取CEP。目前CEP的提取方法主要是Ca2+-free法，Yamamoto等[4]采用此法提取了Lactobacillus helveticus CP790的CEP；本实验室郭宇星等[5]采用过超声波处理法提取瑞士乳杆菌的CEP；Coolbeard等[6]用溶菌酶处理法从Lactococcus lactis subsp. cremoris H2中提取到了CEP；Martin-Hernandez等[7]采用Triton X-100和NP-40共同处理Lactobacillus helveticus L89细胞壁，抽提出CEP。本实验将采用以上3种方法提取发酵乳杆菌CEP，并且对相对较好的方法进一步优化改进，最大效率的从发酵乳杆菌中获得CEP，以进一步研究其酶学性质及对乳蛋白的水解度和ACE抑制活性。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)由本实验室分离保藏。

考马斯亮蓝G-250 国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白 南京赛吉科技有限公司；MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA(MS-Arg) 北京赛百盛基因技术有限公司；溶菌酶(酶活力＞20000U/mg) 上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 仪器与设备

LRH-250A生化培养箱 广东省医疗器械厂；超净工作台 上海上净净化食品有限公司；PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂；722-可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；CL-22M高速冷冻离心机 赛特湘仪离心机仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 菌体制备

菌体在固体培养基上连续活化三代，再接入液体培养基中，按体积分数3%接种量，37℃条件下扩大培养至生长对数期(16h)取出，4℃、4500r/min离心20min收集菌体沉淀。用含有30mmol/L Ca2+的50mmol/L Tris-HCl (pH7.1)缓冲液洗涤菌体[5]，4℃、4500r/min离心20min，弃上清液，重复洗涤3次，收集菌体备用。

1.3.2 酶液提取方法[8]

Ca2+-free法：取菌体2g，用含有2mmol/L EDTANa2的50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)10mL重新悬浮菌体，搅匀，在30℃保温30min，于4℃、4500r/min离心20min，取上清液即为粗酶液。

溶菌酶裂解法：取菌体2g，用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA-Na2、100mmol/L NaCl、体积分数0.5%Triton X-100、1mg/mL溶菌酶，pH8.5)40mL悬浮菌体，37℃保温3h，于4℃、4500r/min离心20min，上清液即为粗酶液。

超声波破碎法：取菌体2g，用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.1)10mL重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎，超声波破碎条件为破碎功率300W、破碎时间3s、间隔时间5s、200次。取破碎液于4℃、4500r/min离心20min，取上清液即为粗酶液。

1.3.3 CEP酶活力测定[9]

取0.02mL底物MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA(MS-Arg) (16.4mmol/L)，酶液0.04mL，1.14mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7.8)混合，在37℃保温60min。用0.5mL、体积分数30%乙酸终止反应，在410nm波长处测定吸光度(测定时补充2.3mL蒸馏水)。空白对照管，以蒸馏水代替酶液同样条件操作。

酶活力单位定义：37℃，每小时A410nm增加0.10定义为一个酶活力单位(U/mL)。

1.3.4 蛋白质含量测定[10]

采用考马斯亮蓝法。取0.1mL样品、0.9mL蒸馏水、5mL蛋白试剂(100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇中，再加100mL 85%磷酸，用双蒸水补至1000mL)，充分振荡混匀，5min后于波长595nm处测定吸光度，以1mL重蒸水作为空白对照。

2 结果与分析

2.1 提取方法的确定

Haandrikman等[11]报道提取乳球菌CEP的方法一般都采用Ca2+-free法，此法中加入的EDTA-Na2可以螯合蛋白酶上的Ca2+，Ca2+可以稳定CEP的结构，一旦Ca2+缺失，乳球菌细胞壁蛋白酶结构就会改变，CEP就会从细胞壁上解离下来。但在本实验中采用Ca2+-free法提取发酵乳杆菌的CEP效果不是很好，说明发酵乳杆菌的CEP和乳球菌的CEP结构可能存在某些不同。CEP的C-末端含有一段疏水性残基序列(transmembrane，TM)，其主要功能是锚定在细胞壁上或者细胞膜上[12-13]。有研究报道，采用Ca2+-free法提取出的蛋白酶只是暴露在细胞壁外的N-端序列，所以提取率不高[7]。若要获得较高提取率，就必须破碎细胞膜，常用的破壁方法有超声波处理法、溶菌酶处理法和表面活性剂处理法等。于是本实验尝试了溶菌酶结合表面活性剂处理法和超声波处理法提取发酵乳杆菌的CEP，结果见表1。

表1 CEP提取方法比较Table 1 Comparison among three methods for the extraction of cellenvelope protainase

从表1可以看出，同样是2g菌体，溶菌酶裂解法可以获得更高含量的CEP，所以可能是超声波破碎法破碎程度过于剧烈不适宜提取发酵乳杆菌的CEP，而采用溶菌酶处理菌体的方式则比较合适。

2.2 溶菌酶裂解法提取CEP

2.2.1 裂解液成分的单因素试验

2.2.1.1 溶菌酶质量浓度对CEP提取的影响

图1 溶菌酶质量浓度对CEP提取的影响Fig.1 Effect of lysozyme concentration on the extraction of cellenvelope protainase

溶菌酶通过水解菌体细胞壁的肽聚糖中的β-1,4糖苷键破坏细胞壁[6]，溶菌酶的质量浓度直接关系到CEP的释放，结果见图1。可见当溶菌酶质量浓度达到2mg/mL时，CEP的释放量基本达到最大。

2.2.1.2 EDTA-Na2浓度对CEP提取的影响

EDTA-Na2除了可以螯合蛋白酶上的Ca2+，改变CEP的构象外，还对细菌细胞外层膜有破坏作用。细胞外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA-Na2将离子螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞外层膜出现洞穴，而CEP的C-末端又锚定于细胞膜上，外层膜的破坏直接导致蛋白酶的脱离。结果见图2。

图2 EDTA-Na2浓度对CEP提取的影响Fig.2 Effect of EDTA-Na2concentration on the extraction of cellenvelope protainase

由图2可知，对于提取发酵乳杆菌CEP，EDTANa2的作用并不大，甚至当浓度达到一定程度时还会抑制CEP的活性。查文献[14]可知，EDTA会抑制金属蛋白酶的活性，据此可初步推断CEP可能是金属蛋白酶，而且这也可能就是Ca2+-free法对发酵乳杆菌CEP提取效率不高的主要因素之一。

2.2.1.3 非离子表面活性剂对CEP提取的影响

图3 非离子表面活性剂对CEP提取的影响Fig.3 Effect of nonionic surfactant type on the extraction of cellenvelope protainase

非离子表面活性剂也会促进CEP的释放，其对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，因此其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层，可以使CEP的C-末端从细胞膜上脱落下来。而且非离子表面活性剂对蛋白的变性作用影响较小，其影响可以通过Sephadex LH-50除去，也可直接上DEAE-Sephadex层析分离目的蛋白，不必除去非离子表面活性剂。本实验比较了几种非离子表面活性剂对提取酶的影响，添加量均为体积分数0.5%，结果见图3。可见添加Tween-20更有利于CEP的释放。

2.2.1.4 Tween-20添加量对CEP提取的影响

Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力，且相对于其他类型的Tween要更温和一些，其添加量对提取CEP的影响见图4。可见，Tween-20的添加量在达到2%时酶活力已经趋于平衡了。

图4 Tween-20添加量对CEP提取的影响Fig.4 Effect of Tween-20 concentration on the extraction of cellenvelope protainase

2.2.1.5 NaCl浓度对CEP提取的影响

图5 NaCl浓度对CEP提取的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on the extraction of cell-envelope protainase

少量离子的作用，可以减少蛋白质分子极性基团之间的静电引力，加强蛋白质与提取液之间的相互作用，从而促进溶解[15]。由图5可见，NaCl浓度达到150mmol/L时，CEP的提取效果更显著。

2.2.1.6 pH值对CEP提取的影响

提取液的pH值应在酶的稳定pH值范围内，并应远离其等电点的pH值，使蛋白质分子带上净电荷，以增大其溶解度[15]。从文献[13]查得CEP的pI值为4.5，且根据前人用溶菌酶法提取CEP的经验，本实验选用8.0、8.5、8.9进行正交试验，比较不同pH值对CEP提取的影响。

2.2.1.7 裂解液成分的正交试验优化

在单因素试验结果基础上，确定了裂解液成分正交试验的几种考察因素及水平，以酶比活力(酶比活力=酶活力/蛋白质含量)为指标，结果见表2。

表2 裂解液成分的正交试验结果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing the composition and pH of cell lysis solution

综合分析表2可知，A、B、C、D四因素中，因素B、A是最重要的，且都是第3水平最优，这反映出非离子表面活性剂(Tween-20)和溶菌酶是裂解液最关键的两个因素，另外两个因素的影响相对小一些。以酶比活力为指标，得出裂解液影响CEP提取的程度大小顺序为Tween-20添加量＞溶菌酶＞pH值＞NaCl，极差分析得出最优水平组合是A3B3C2D3，而9个试验组中最佳组合条件为A3B3C2D1，经验证A3B3C2D3组合条件下所得酶比活力为26.438U/mg，效果更好。因此，确定提取发酵乳杆菌CEP的裂解液成分为：50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、3% Tween-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9。

2.2.2 CEP提取条件的优化

2.2.2.1 裂解液与菌体的比例

图6 裂解液与菌体的比例对CEP提取的影响Fig.6 Effect of cell lysis solution/ Lactobacillus fermentum cells ratio on the extraction of cell-envelope protainase

由图6可知，在裂解液与菌体的比例在10:1时，CEP的酶比活力达到最大。

2.2.2.2 保温时间

图7 保温时间对细胞壁蛋白酶提取的影响Fig.7 Effect of incubation time on the extraction of cell-envelope protainase

由图7可知，随着保温时间的延长，CEP蛋白酶活力基本呈增大趋势，4.5h时蛋白酶活力达到最大。

2.2.2.3 保温温度

图8 保温温度对CEP提取的影响Fig.8 Effect of incubation temperature on the extraction of cellenvelope protainase

由图8可知，随着温度的上升，酶活力、蛋白质含量、酶比活力都呈增大趋势，当保温温度为41℃时，蛋白质释放量基本趋于平衡，酶活力和酶比活力都达到最大值。

2.2.2.4 提取条件正交试验的优化

在单因素试验结果基础上，确定了提取条件正交试验的几种考察因素及水平，以酶比活力为指标，结果见表3。

从表3的极差可以看出，各个因素影响CEP提取的大小顺序为裂解液与菌体的比例＞保温时间＞保温温度，通过直观分析得出最优水平组合是A2B3C1，而9个试验组中最佳组合也为A2B3C1。因此，确定提取发酵乳杆菌CEP的提取条件为：裂解液与菌体的比例10:1、保温时间5h、保温温度37℃，在该条件下所得酶比活力为38.957U/mg。

表3 提取条件正交试验结果Table 3 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing three extraction conditions

3 结 论

本实验确定了从发酵乳杆菌中提取CEP的方法：用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、体积分数3% Tween-20、2mg/mL溶菌酶、pH8.9)悬浮菌体(10:1)，37℃保温5h，于4℃、4500r/min离心20min后取上清液即为粗酶液。本实验确立了溶菌酶结合非离子表面活性剂法提取发酵乳杆菌CEP的基本实验路线，方法简便，所得酶活力也较高。关于发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的酶学性质、结构及特性还有待于进一步研究。

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Extraction of Cell-envelope Proteinase from Lactobacillus fermentum

ZHU Xu1，PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch of National Dairy Products Processing Technology Developing Center, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Lysozyme treatment was selected out of three commonly used ways for extracting cell-envelope protainase from Lactobacillus fermentum cells in the present study. The composition and pH of cell lysis solution and three extraction conditions were optimized using orthogonal array design. The best cell lysis solution was a mixture of 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 3% Tween-20 and 2 mg/mL lysozyme at pH 8.9. Cell lysis solution/ Lactobacillus fermentum cells ratio of 10:1 (V/m) and incubation time of 5 h at a constant temperature of 37 ℃ were found optimal for the extraction of cell-envelope protainase, and the maximum specific enzyme activity was up to 38.957 U/mg under these conditions.

Lactobacillus fermentum；cell-envelope proteinase；extraction

TS201.3

A

1002-6630(2010)19-0268-05

2010-01-28

朱姁(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为乳品科学。E-mail：jsdfzhuxu@hotmail.com

*通信作者：潘道东(1964—)，男，教授，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：daodongpan@126.com