康传真,程晓杰,陈西广
中国海洋大学海洋生命学院.青岛 266003
壳聚糖及其衍生物温敏水凝胶研究进展及其应用
康传真,程晓杰,陈西广*
中国海洋大学海洋生命学院.青岛 266003
壳聚糖基温度敏感性水凝胶具有原位成胶的特点,广泛应用于组织工程修复和药物释放载体的研究中。近年来围绕壳聚糖及其衍生物温敏水凝胶的研究逐年增多,本文综述了近年来壳聚糖基温敏水凝胶的研究进展及其应用。
壳聚糖;甘油磷酸盐;温敏水凝胶;药物释放载体;组织工程
温度敏感水凝胶能够感受外界环境温度的变化而发生溶胶-凝胶转变或者可逆体积转变,广泛应用于组织工程、药物释放系统等的研究。可用于制备温敏水凝胶的材料已发现很多种,如:聚-N-异丙基丙烯酰胺(PN IPAM)、泊洛沙姆 (Poloxamer)、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯酰胺(PAAm)等合成高聚物,以及纤维素及其衍生物[1,2]、壳聚糖及其衍生物等天然高聚物。本文就近年来有关壳聚糖及其衍生物所形成的温度敏感性水凝胶以及其应用的研究情况进行综述和讨论,文中所涉及的壳聚糖类温敏水凝胶均是指在低温条件下保持可流动性液态而在高温条件下会自发交联形成不可流动的半固体状的水凝胶[3]。这种具有热致成胶特性的温敏水凝胶,制备条件温和,相变温度与人体体温接近甚至低于人的体温,具有良好的生物相容性和生物可降解性,因而在组织工程和药物缓释载体等方面具有极大的应用潜力,已经引起人们的广泛关注,相关的研究报道也在逐年增多。
壳聚糖 (chitosan,CS)为聚阳离子多糖,具有良好的组织相容性、生物可降解性和黏膜粘附性,在医学、生物学领域得到了深入的研究和广泛的应用。CS分子链上的羟基 (-OH)、氨基 (-NH2)和 N-乙酰氨基之间形成的分子内和分子间氢键,以及其分子的立体规整性,使其在多数有机溶剂、水、碱中难以溶解,但是在稀酸溶液中,-NH2被质子化为破坏了分子内部的氢键和立体规整性,-OH与水分子发生水合作用,导致了 CS分子膨胀而溶解。调节溶液 pH至碱性时,CS分子就会立即絮凝沉淀。甘油磷酸盐 (Glycerophosphate,GP)为强碱弱酸盐,低温条件下弱碱性的 GP溶液中和 CS溶液至 pH 6.5以上,和磷酸基团静电结合,CS分子之间的静电斥力降低;另外 GP是一种多羟基化合物,多羟基化合物能够保护蛋白质等大分子物质的水合状态,促进其在水中的溶解[4],因此即使中性 pH条件下 CS也不会发生絮凝。随着温度的升高,体系中氢键作用力减弱,CS分子之间的疏水相互作用迅速增强,CS分子相互聚集交联,体系由流动的溶胶转变为半固体状的凝胶[5,10.13-15]。
2000年,Chenite等[5-8]最先报道了这种 CS/GP温敏凝胶体系的制备,即 0.2 g CS溶于 9 mL的 0.1 mol/L稀盐酸溶液中,冰浴条件下将 GP溶液(56%, M/V)滴加到 CS的盐酸溶液中。继续冰浴搅拌充分混合,将其置于 37℃环境下即可迅速凝固为半固体状水凝胶。
1.1 壳聚糖材料对成胶性能的影响
脱乙酰度和相对分子质量是 CS的两项主要的性能指标,它们对 CS许多性质都有影响,例如这两项指标都明显影响 CS的溶解性能:相对分子质量小于 8 kDa的 CS可以直接溶于水而不需借助酸的作用。而随着分子量的增大,分子内和分子间会形成更多氢键,同时分子更易于缠绕在一起,CS水溶性变差,即使在酸溶液中也难以溶解;脱乙酰度越高CS分子中的氨基质子化程度越高,水溶性越好。研究结果发现分子量、脱乙酰度对壳聚糖成胶效果有显著影响。
Ruel-Garie′py等[6]发现随着 CS脱乙酰度的增大,其成胶温度呈降低趋势;脱乙酰度为 92%时样品成胶温度下降为 27℃。我研究室的周惠云等[9]研究了 CS分子量高低和脱乙酰度大小与其成胶性能的关系。37℃条件下,分子量大于 1130 kDa的CS所制备的 CS/GP体系的旋转粘度随保温时间的延长而增大,分子量为 1360 kDa时体系旋转粘度增长最快;脱乙酰度为 75.4%时体系的旋转粘度增长最快,而其他脱乙酰度时体系旋转粘度则无明显变化。
1.2 甘油磷酸盐对成胶性能的影响
甘油磷酸盐具有两种异构体:α-甘油磷酸盐和β-甘油磷酸盐 [Fig.1]。α-甘油磷酸盐是线性分子结构,β-甘油磷酸盐为非线性分子结构,两者在体系内部引起的空间位阻不同,因此对壳聚糖成胶速度有明显影响。
Zhou和Wu等[9,10]分别研究了两种甘油磷酸盐(β-甘油磷酸盐和α,β-甘油磷酸盐混合物)对于成胶性能的影响,研究表明α,β-较β-具有更快的成胶速度。Wu等研究发现 CS和 GP浓度相同的条件下,α,β-制备的水凝胶成胶时间为 14 min,而β-则为33 min。这是因为α,β-中的α-为线性分子结构,其形成的空间位阻较β-的要小,体系中的 CS分子间的疏水相互作用更易于形成。
图 1 α-GP(a)和β-GP(b)的分子结构[10]Fig.1 Molecular structure of(a)α-GP and(b)β-GP[10]
1.3 不同酸溶剂对成胶性能的影响
CS不溶于水和碱溶液,可溶于大多数有机酸溶液,以及稀的盐酸、硝酸等无机酸溶液,不溶于稀的硫酸、磷酸。不同酸配制的CS溶液的pH、粘度以及稳定性等存在差异[11],使用不同酸溶解 CS之后所制备的溶胶的成胶性能也有差异。
我研究室的赵庆升等[12]研究了 CS在不同稀酸溶剂中的溶解性,并考察了不同酸溶解的 CS的成胶性能。研究发现所有单价酸 (包括甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、乳酸、硝酸、盐酸和氯乙酸)配制的 CS溶液,加入 GP后均可在 2~5 min内成胶,而二价酸(包括硫酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、抗坏血酸)和三价酸 (包括磷酸和柠檬酸)则均不能成胶。原因可能在于多价酸溶解 CS时需用更多的 GP中和剩余的酸,而 GP浓度过高时导致 CS的沉淀析出,因而无法成胶。以上几种羧酸的成胶时间无明显区别,均为 2 min,而氯乙酸则稍长,为 3 min。扫描电镜结果显示除以乳酸为溶剂制备的水凝胶内部呈明显的絮凝聚集结构外[Fig.2-f],其他各种水凝胶均为多孔分枝状结构[Fig.2],孔径大小因酸的种类而异,羧酸的烃链越长,孔径越大。
CS分子的单糖残基上有三个活性基团:分别是C2-NH2、C6-OH和 C3-OH。在-NH2和-OH上能发生接枝反应,生成一系列 CS衍生物 (如酯化反应、醚化反应等),从而制备得到溶解性能更好或具有其他特殊性能的 CS衍生物,其中有些衍生物水凝胶在温敏方面的研究已经被报道。
2.1 壳聚糖季铵盐温敏水凝胶
Wu等[10]利用失水甘油基三甲基氯化铵 (GTMAC)和 CS反应,制备了水溶性的季铵化衍生物N-(2-羟基)丙基-3-甲基氯化铵壳聚糖 (HTCC)[Fig. 3]。研究发现,HTCC溶液与 GP溶液共混后的体系(HTCC/GP)同样具有类似 CS/GP的温敏特性,即在低温或室温保持溶液状态,而在37℃或更高温度条件下发生凝胶化。与 CS/GP水凝胶相比,HTCC/ GP水凝胶呈现透明态,对环境的 pH更加敏感。
本研究室的吉秋霞等[38]制备了温敏性更好的CS/HTCC/GP温敏水凝胶,通过调节体系内 CS和HTCC的比例,能够调节成胶温度到 25℃。
图 3 HTCC的合成方案[10]Fig.3 Synthesis scheme of HTCC[10].
2.2 羟丁基壳聚糖温敏水凝胶
羟丁基壳聚糖 (HBC)的制备是在 CS上的-NH2、C6-OH或 C3-OH上引入羟丁基基团制备的衍生物,羟丁基结合到 CS上赋予 CS良好的水溶性。Dang等[16]发现 HBC水溶液同样具有温敏特性,其成胶温度低于人体正常温度,取代度为 1.33%、 1.75%、1.96%时成胶温度分别为 29、18、13℃;且成胶速度更快,如浓度为 3.8%的 HBC水溶液在37℃下成胶时间小于 60 s。这种凝胶的机械性能良好,能用镊子直接钳起。而低温条件下,该凝胶又可重新转变为可流动状态。
3.1 壳聚糖/聚乙烯醇/碳酸氢钠温敏水凝胶
低温条件下,在 CS酸溶液中滴加碳酸氢钠和聚乙烯醇(PVA)的混合溶液,制备得到的 CS/PVA/ NaHCO3的混合物溶液,同样具有温敏性。Tang等[17]制备了这样的共混温敏水凝胶,具体的制备方法是:低温条件下将预先配置好的 PVA和碳酸氢钠的混合液滴加到 CS盐酸溶液(2%,w/v)中,得到均质、透明、低温可流动的 CS/PVA/NaHCO3共混溶液,37℃条件下放置 30 min即可转变为半固体状水凝胶。成胶机理如图 4所示:
图 4 壳聚糖/聚乙烯醇水凝胶的形成机理Fig.4 Formation mechanism of chitosan/PVA gel
NaHCO3是强碱弱酸盐,其水溶液中呈弱碱性,能够中和 CS溶液至中性.低温条件下,PVA作为多羟基化合物能够保护 CS在中性条件下保持溶解状态,。当环境温度升高到 37℃时,体系内部的氢键作用力减弱,CS分子周围结合的水分子丢失,疏水片段暴露出来,CS分子因疏水相互作用而结合,体系转变为凝胶。在成胶过程中,疏水相互作用是主导作用力。随着 PVA含量百分比的增大,共混溶液的成胶温度和成胶时间都会增大,这是因为,PVA含量越大,亲水性越强,体系中氢键作用力越大,成胶时克服氢键所需能量越大。
3.2 壳聚糖季铵盐/聚乙二醇/甘油磷酸盐温敏水凝胶
Wu等[18]制备了壳聚糖季铵盐 (HTCC),聚乙二醇 (PEG)和少量α,β-GP的混合物,证明该混合物具有良好的温敏性,室温下呈液态,而 37℃环境下数分钟转变为凝胶。α,β-GP的加入能调节体系pH至中性,并与 CS分子上的-NH3+发生静电结合,降低HTCC分子间的静电斥力。PEG分子两端的羟基,同 CS分子上的氨基和羟基形成氢键,促进 CS分子间的交联作用;相同分子量的甲氧基聚乙二醇(MPEG)替代 PEG则不能成胶,表明 PEG分子两端的羟基对于成胶的必要性。低分子量 PEG对于成胶的促进效果不如高分子量 PEG,这是因为小分子量的 PEG水溶性更好,亲水性更强,与水分子之间的氢键更加紧密,成胶时克服氢键作用而消耗的能量更大,阻碍凝胶形成。
Wu等还研究了该温敏系统作为鼻腔药物缓释系统的可行性,包埋亲水性的大分子药物胰岛素作为模型药物,室温下将其滴加到小鼠鼻腔中,能够良好的吸附在鼻粘膜上,形成凝胶,并能抵抗鼻腔内粘膜纤毛的清除作用,保证药物缓慢稳定的释放,促进亲水性的大分子药物的吸收。
接枝共聚物是在一种大分子均聚物链上进行接枝,连接上另外一种均聚物大分子,所获得的接枝共聚物保留原有分子的一些性质,同时又被赋予新的理化特性。
4.1 壳聚糖-聚-N-异丙基丙烯酰胺接枝共聚物(CS-g-PN IPAM)温敏水凝胶
Cho等、Chen等[19,20]分别制备了 CS水溶性接枝共聚物 CS-g-PN IPAM,用于制备温敏水凝胶。Chen等首先合成了带有羧基末端的聚-N-异丙基丙烯酰胺分子 (PN IPAM),以 CS分子作为骨架,利用羧基和氨基分子之间反应生成酰胺键,将 PN IPAM连接到 CS分子骨架上,制备得到梳状的接枝共聚物(CS-g-PN IPAM,CPN)[Fig.5]。与 CS相比,该接枝共聚物具有更好的可逆的温敏性,其成胶温度为30℃。扫描电镜观察该凝胶内部具有多孔的三维结构,孔径为 10~40μm。
Cao等[21]制备了 CS-PN IPAM接枝共聚物,该共聚物具有水溶性、温敏性,其成胶温度为 32℃,这与人眼表面的温度接近,因此 CS-PN IPAM作为原位成胶材料,用于眼疾治疗药物释放载体,具有很大可行性。
图 5 PN IPAM-COOH(a)、壳聚糖(b)和 CPN(c)的分子结构[20]Fig.5 Molecular structures of PN IPAM-COOH(a).chitosan(b)and CPN(c)[20]
4.2 壳聚糖-聚乙二醇接枝共聚物 (CS-PEG)温敏水凝胶
CS和聚乙二醇 (PEG)及其各种衍生物反应生成接枝共聚物,包括 PEG酯、PEG磺酸酯、PEG酸、PEG醛、PEG丙烯酸盐和 PEG碘化物等[22]。PEG的加入不仅能够改善 CS的水溶性和生物相容性,而且不改变聚合物原有的温敏性。
Bhattarai等[23]将甲氧基聚乙二醇 (mPEG)接枝到 CS的氨基上制备接枝共聚物,该共聚物可溶于水,并且具有可逆的温敏性,37℃成胶。PEG接枝率 >40%时接枝共聚物可溶于水,45%~55%时能成胶,接枝率过高会抑制分子内的疏水相互作用,阻碍成胶。成胶机理是:低温时分子中的亲水基团同水分子形成氢键,共聚物溶于水中,高分子链呈伸展状态,黏度低,具有流动性;温度升高 CS分子片段间的疏水相互作用占主要地位,从而交联成胶。
Zhang等[24]将单甲氧基醚聚乙二醇 2000 (mPEG2000)接枝到 CS上制备接枝产物 mPEG-g-CS,得到了接枝率分别为 22.4%、38.5%和 50.9%的产物 G1、G2和 G3。该接枝共聚物溶解性较 CS要好,且接枝率越高,溶解性越好,G2和 G3在中性和弱碱性条件下仍可溶。其溶液具有温敏性,浓度在 0.9%~1.1%之间的mPEG-g-CS溶液具有良好的温敏性能,37℃下 3~10 min成胶;而浓度大于1.3%时在室温下流动性很差,已无明显温敏性;浓度小于 0.8%时,37℃下大约需要 3 h以上才能成胶;更低的浓度时,则不形成凝胶。G3制备的水凝胶包载的疏水性药物可持续释放一周以上。mPEG-g-CS温敏水凝胶有望成为理想的注射式植入型药物释放载体。
4.3 壳聚糖-泊洛沙姆接枝共聚物温敏水凝胶
Chung等[25]使用 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)作为交联剂,将泊洛沙姆 (Pluronic)接枝到 CS分子上制备得到水溶性的共聚物[Fig.6]。与 CS相比该共聚物具有更低的成胶温度,在 34℃附近具有可逆的溶胶-凝胶转变。CS和 Pluronic的含量影响制备的产物的成胶性能,CS含量增大,成胶温度升高,当达到 17 wt%时,共聚物不能成胶。
图 6 利用 EDC/NHS合成壳聚糖-泊洛沙姆共聚物的合成路线[25]Fig.6 Synthetic route of chitosan-pluronic using EDC/NHS[25]
5.1 壳聚糖/甘油磷酸盐温敏水凝胶与脂质体的结合
小分子量物质在水凝胶的释放速度较快,缓释效果不够理想,针对这一缺陷,大量研究将脂质体加入到凝胶体系中,这样既能将载药的脂质体固定在生物体某一特定部位上,又能减缓药物的释放速度[26-28]。
Ruel-Garie′py等[29]将包载羧基荧光素的脂质体加入到 CS/GP中并研究其对羧基荧光素的缓释效果。在 0~15μmol/mL范围内,脂质体的加入对成胶速度和凝胶强度有一定的促进作用,这是因为电中性的脂质体同 CS分子之间存在比较强烈的疏水作用。同 CS/GP相比,CS/GP中的脂质体内包载的药物释放速率明显减慢,并能持续数周。影响药物释放速率的因素有:脂质体大小、脂质体中胆固醇的加入与否、释放介质中磷脂酶的存在与否,随脂质体直径的增大,药物的突释效应和释放速率都明显减慢。多层膜脂质体的释放速率更慢,7 d才释放了6%。
5.2 壳聚糖/甘油磷酸盐温敏水凝胶与微纳米球的结合
在 CS/GP温敏水凝胶体系中加入微米球、纳米球等粒子,能够明显改善水凝胶体系的温敏性,增强凝胶强度[30]。
Xiao等[31]将壳聚糖季铵盐纳米粒加入 CS/GP温敏水凝胶体系中,研究纳米粒子对温敏体系的影响。微纳米粒子的加入不影响体系 pH值,且 37℃条件下体系成胶时间缩短,因为微纳米粒子的加入,使体系中离子间相互作用的距离缩短。溶液成胶情况与微纳米粒子的大小及其加入量有关。粒径大的纳米粒对成胶的促进作用更明显,因为粒径大的纳米粒促使高分子间发生离子交联的几率更大;对于同种粒径纳米粒,加入量越多,成胶时间越短,但加入量过多(0.96 g/L)时,由于离子交联的影响,溶液的初始粘度增大(从 100 mPa·s增大到 500 mPa ·s),影响溶液的流动性,体系不具有明显的温敏性。纳米粒的加入使得温敏体系的凝胶强度有所增强。释药结果显示,微纳米粒子的加入减慢了 BSA在凝胶中的释放速率。
Zan等[32]将载有 5-氟尿嘧啶的聚羟基丁酸酯微球添加到 CS/GP温敏水凝胶体系中,并研究其对药物的缓释性能。体外释药研究表明复合体系能够显著降低药物突释行为 (从原来的 85%降低到29%),包埋的药物能够持续释放长达10个月之久。
Couto等[33]将生物玻璃纳米粒加入到 CS/GP温敏水凝胶体系中,应用于整形外科。随着加入的生物玻璃纳米粒含量的增大,体系成胶温度降低,这可能是由于生物玻璃纳米粒影响了 CS分子之间的疏水相互作用,促进凝胶形成。生物玻璃纳米粒含量为 40%和 50%的时候成胶温度分别为 36.9℃和36.8℃,可用于体内注射。将该水凝胶在人工体液中孵育一段时间后能观察到水凝胶内部的骨状羟基磷灰石的产生,随着纳米粒含量的增大和孵育时间的增长,形成的羟基磷灰石的密度增大。该可注射性凝胶体系在骨组织工程中用作临时支架具有一定可行性。
除了有机磷酸盐(甘油磷酸盐)外,无机磷酸盐也可用于中和 CS溶液,制备温敏成胶体系。
Nair等[34]在 CS溶液中加入不同浓度的磷酸氢铵(AHP)制备了 CS/AHP温敏水凝胶。CS/AHP同CS/GP具有相似的温敏性,但不具有可逆性。同CS/GP体系相比较,CS/AHP体系所需要的AHP量要比 GP量小,且成胶速度更快。加入 AHP后 CS体系的 pH增大,但当 pH<7时不能成胶,在实验研究范围内,随着AHP浓度的增大,37℃条件下 CS/ AHP体系的成胶时间缩短。CS/AHP具有良好的细胞相容性,可用作干细胞的载体和大分子药物释放载体。
Ta等[35,36]制备了 CS/K2HPO4温敏水凝胶,该体系同 CS/GP具有相似的温敏性。弱碱性的K2HPO4具有 GP相似的效果,低温下能够有效调节CS酸溶液的 pH至中性且不产生絮凝,而碱性较强的 K3PO4和呈酸性的 KH2PO4则不能用来制备 CS温敏体系,可以看出 pH值对 CS溶液成胶与否有很大影响。pH>6.2时体系才能成胶。但 pH过大,低温条件下 CS分子也会立刻发生絮凝沉淀。三种磷酸盐加入后,CS体系 pH变化如下[Table 1]:
表 1 不同摩尔比例条件下制备的壳聚糖/无机磷酸盐混合溶液的 pH和成胶情况[35]Table 1 pH and ability to gel of chitosan/orthophosphate solutionswith differentmolar ratios of chitosan to salt[35]
CS和 K2HPO4的浓度对于成胶速度、成胶时间、药物释放特征都有显著影响。一定范围内,CS和 K2HPO4浓度的增大都能缩短成胶时间,降低成胶温度,可以通过控制这两个因素达到控制体系的成胶时间和温度的目的。CS浓度明显影响药物突释效应和释放速率,而 K2HPO4的浓度只是影响药物的突释效应,对药物释放速率影响不大。包载药物的分子量、分子结构以及带电性质也都影响药物的释放特征。
水凝胶在低温下呈流动的状态,而当温度升至人体温度时将会变成不可流动状态,具有可注射性。低温下在溶胶内包载活细胞、蛋白分子或其他的药物,注射到人体后成胶,可作为组织工程支架或智能药物缓释载体。
7.1 药物释放载体
原位作用植入型药物释放系统,是经手术植入体内或皮下或经穿刺导入皮下的控释制剂,是一种长期给药体系,克服了需长期用药时传统给药方法的缺点,能长期稳定控制靶向部位药物浓度或血药浓度,提高药物的生物利用度,从而减少用量、降低副作用。药物应用范围也由当初的避孕治疗扩展到抗肿瘤、胰岛素给药、心血管疾病、眼部疾病、抗结核、骨髓炎以及疫苗等多种治疗领域。水凝胶是亲水性多聚物交联形成的三维多孔网络结构,内部含有大量的水分,其三维多孔结构类似于人体内部基质的结构.宏观上水凝胶是半固体状态的,微观上来看其网孔内部则包含大量的水分,小分子物质在其内部又可以溶液状态存在[37].水凝胶现在已经被用作很多蛋白质、药物或者基因等的载体,作为原位作用植入型药物释放系统应用。
CS水凝胶因其具有生物可降解性,因此植入后无需手术取出,即可被机体降解吸收,免除手术痛苦。因此常用 CS水凝胶包载一些比较敏感的蛋白类药物如胰岛素,或者生物半衰期比较短,口服不稳定,以及全身毒副作用比较大的药物[7,10]。释放初期,主要是分散在凝胶网孔内的药物通过扩散作用而释放,后期则是连接在水凝胶网状结构上的药物通过水凝胶的溶蚀作用而被释放出来。
本研究室吉秋霞等[38]利用 CS/HTCC/GP共混制备了温敏水凝胶,用于奥硝唑和氯已啶的体外释放研究,其缓释效果明显;大鼠股部肌肉内原位注射结果表明,此水凝胶具有良好的组织相容性,临床使用安全;通过建立犬牙周组织缺损病理模型,证明CS/HTCC/GP温敏水凝胶是良好的生长因子载体,且具有较强的促进牙周组织再生的作用。
Han等[39]在 CS水凝胶中包载了阿霉素和牛痘疫苗,化学疗法和免疫疗法同时进行,作为抗肿瘤药物原位释放载体。动物实验结果表明,水凝胶中的牛痘疫苗和阿霉素具有协同作用,能够有效抑制肿瘤生长。
7.2 组织工程支架材料
组织工程采用可注射原位形成水凝胶.与预成型支架相比具有特定的优势:能填充任意形状的缺损,并在很大程度上降低植入对机体组织的侵入性,且能与各种治疗药物混合。可注射性水凝胶材料是携带细胞的载体,具有携带细胞、促进细胞体内移植区滞留及增殖与分化的作用,是可注射性组织工程的重要组成部分。CS是胞外基质类似物,CS水凝胶具有三维多孔结构,它具有生物相容性好、成胶时间及体内降解时间可调控等优点,在软骨组织工程等领域已经得到应用[40-41]。
Hao等[42]制备了 CS/GP温敏水凝胶,通过 SD大鼠肌内注射植入,进行组织相容性检测;与软骨细胞复合构建组织工程化软骨,观察软骨细胞在 CS水凝胶中的存活情况,并于体外培养 3周后,做相关组织形态学检测。组织相容性检测表明,该材料具有良好的组织相容性,植入体内 2、4周时有少量炎性细胞浸润,6周时材料降解明显,8周时已经基本降解;组织形态学检查,观察到软骨陷窝样结构,软骨细胞具有分泌细胞外基质的功能。Xu等[43]采用CS水凝胶在心梗部位进行局部注射,通过对 CS水凝胶在注射部位存留及降解情况的观察以及术后 4周的组织形态学、免疫组织化学检查,探讨其促血管生成及心肌保护作用。结果发现,与单纯心梗组和PBS组比较,CS水凝胶注射组梗死壁中部和边缘区域血管密度显著增加,心室壁明显增厚 (P<0.01),为将来以 CS水凝胶为支架材料研制可注射性组织工程化心肌奠定了基础。
Cho等[19]制备了水溶性 CS-g-PN IPAm衍生物,该衍生物具有类似 CS/GP的温敏性,其成胶温度为32℃。间充质干细胞悬液和该高聚物溶液混合,体外、体内分别成胶后培养,观察细胞的增殖分化情况。体内注射结果表明,在培养的 3个月内,间充质干细胞在体内能分化为软骨细胞,并逐渐生长形成软骨组织块,多聚体支架缓慢降解被机体吸收。另外,该凝胶对于小分子具有非常好的渗透性,这非常有利于软骨的形成。
7.3 制备细胞单层用于特殊组织工程需要
温敏性聚合物在组织工程等领域应用前景非常好,因为其从较高温度降低至低临界相转变温度以下时,分子的亲水性和疏水性状态会发生急剧的变化,吸附生长在温敏性聚合物表面的细胞层会自发的脱落到细胞培养液中,因而不需要酶等处理即可获得细胞单层,而应用于组织工程。传统的制备方法通常会破坏细胞间连接,而上述方法操作温和具有更大的优势[44],。Kushida等[45]利用化学接枝法将 PN IPAM接枝到组织培养用的聚苯乙烯上,并利用LCST附近多聚物亲水疏水性的变化,成功地在无酶作用的条件下制备了完整的角化细胞 (Madin-Darby canine kidney(MDCK)cell)、犬的肾细胞以及肝细胞的细胞单层。
图 7 3T3细胞在 CPN水凝胶表面37℃培养 7 d后长成细胞单层,20℃处理 60 min后细胞单层脱落[46]Fig.7 The formation of a detached 3T3 cell sheet after cultured on chitosan-g-poly(N-isoprorylacrylamide)hydrogel at37℃for 7 days followed by cold treatment at 20℃ for 60 min[46].
Chen等[46]制备了温敏性的 CS-g-PN IPAM (CPN),在 CPN水凝胶表面培养细胞至形成细胞单层。利用水凝胶的温度敏感性,低温放置一定时间后,水凝胶转变为液体状态,细胞单层自动脱落下来,收集已制备好的细胞单层应用于其他组织工程研究[Fig.7]。该方法无需酶处理,条件温和,收率高,细胞解吸附效率高达 80%。从凝胶表面上解吸附下来的细胞仍保持较高的活性,转移至新的培养基里可继续分裂增殖。
壳聚糖是一种优良天然生物材料,通过多种制备途径,能够制备得到各种类型温敏水凝胶,从而为研究和应用提供更广阔的空间。壳聚糖温敏水凝胶制备条件温和,且具有良好的生物相容性,可用作多种特殊药物的载体,包括敏感性的蛋白药物、生物半衰期短的药物、口服不稳定药物以及全身毒副作用较大的药物。通过包载载药脂质体、微球、纳米球等用于小分子药物缓释研究,能够明显改善小分子药物缓释效果。壳聚糖温敏水凝胶的理化、生物学性质等都能较好地满足细胞生长、增殖和分化的需要,可用作可注射性组织工程支架材料。但是,从研究报道中也可以发现,目前研究制备的壳聚糖温敏水凝胶性能方面还有些不足,如机械强度不够、低温条件下凝胶-溶胶转变速度慢甚至不具有可逆性等。因此,制备具有良好的生物力学性能、可逆性及快速响应性的壳聚糖基温敏水凝胶以满足不同需求,并最终应用到临床上,依然是今后研究的主要方向。
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The Progress and Application of Thermosensitive Hydrogel Based on Chitosan and ItsDerivatives
KANG Chuan-zhen,CHENG Xiao-jie,CHEN Xi-guang*
College of M arine Life Science.Ocean University of China.Q ingdao 266003,China
Chitosan-based thermosensitive hydrogel could undergo a liquid-solid phase transfor mation when injected from room temperature environment to human body.Cells,proteins and other drugs could be incorporated into the hydrogel and their in situ fixation or release could be realized.So this hydrogel could be applied to cell transplantation for tissue repair and drug delivery.In this paper,the development of chitosan-based thermosensitive hydrogel is introduced,and its application in tissue engineering and drug delivery are reviewed in detail.
chitosan;glycerophosphate;ther mosensitive hydrogel;drug delivery;tissue engineering
R944.1+5
A
1001-6880(2010)05-0919-09d
2009-10-09 接受日期:2009-11-24
科技部国际合作重点项目 (2008DFA31640);教育部博士点基金项目 (20070423013)
*通讯作者 Tel:86-532-82032215;Email:xgchen@ouc.edu.cn