复元胶囊对大鼠实验性骨关节炎软骨IL-6、bFGF的干预研究

梁晓芳，李荣亨，唐 静（重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆市 400016）

复元胶囊对大鼠实验性骨关节炎软骨IL-6、bFGF的干预研究

梁晓芳＊，李荣亨#，唐 静（重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆市 400016）

目的：研究复元胶囊对大鼠实验性骨关节炎（OA）软骨白细胞介素-6（IL-6）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响。方法：Hulth法复制大鼠OA模型，随机分为对照、模型、四环素和复元胶囊高、中、低剂量组。灌胃给药，每天1次，连续10周。10周后取软骨标本，行大体观察、Mankin’s评分及免疫组化测定软骨中IL-6、bFGF的表达水平，并将IL-6、bFGF的表达水平与Mankin’s评分指数进行Pearson相关分析。结果：复元胶囊各组关节软骨Mankin’s评分、IL-6表达水平均低于模型组（P＜0.01或P＜0.05），bFGF表达水平均高于模型组（P＜0.01）；复元胶囊各剂量组Mankin’s评分差异具有显著性（P＜0.05），IL-6表达水平与关节病理改变的Mankin’s评分指数呈正相关（P＜0.01），bFGF表达水平与关节病理改变的Mankin’s评分无明显相关。结论：复元胶囊能下调大鼠OA软骨IL-6的表达，上调bFGF的表达，其作用呈剂量依赖性。高剂量复元胶囊抗大鼠OA作用与四环素相当。

骨关节炎；复元胶囊；白细胞介素-6；碱性成纤维细胞生长因子

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人最常见的关节疾病。OA的产生，是一系列生物化学及生物力学因素共同作用的结果，最终导致软骨基质的降解。软骨基质降解和修复失衡的始发路径由细胞因子及化学增活素介导。在体及体外实验研究均表明，阻断这些细胞因子及化学增活素可消除其效应。在OA患者软骨组织及关节滑液中，白细胞介素-6（IL-6）含量明显升高，并呈随病情加剧而升高的趋势[1]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是目前已知最强的促细胞生长因子，可刺激成软骨细胞增殖和分化，并具有反分化作用，能抑制软骨钙化。研究表明，bFGF参与胶原及软骨细胞的再生[2]，在OA的软骨及基质修复中发挥重要作用。本文主要研究复元胶囊（Fyc）对大鼠实验性OA软骨IL-6、bFGF的影响，探讨其抗OA的作用机制。

1 材料

1.1 仪器

HWS-40B型恒温水浴箱（江苏太仓实验设备厂）；MDF 328型低温冰箱（日本三洋公司）；BX-50型生物显微镜（日本Olympus公司）；HPS-3C型pH计（上海雷磁仪器厂）。

1.2 试药

Fyc（重庆希尔安药业公司，批号：20090203，规格：每粒0.41 g）；四环素（太极集团西南药业股份有限公司，批号：20090412，规格：每片250 mg）；大鼠IL-6及bFGF免疫组化试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；青霉素（华北制药股份有限公司，批号：D0809103）。

1.3 动物

SD清洁级大鼠60只，♂，体质量（300±10）g，由重庆医科大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXY（渝）20020003）。

2 方法

2.1 模型复制及分组、给药

随机选10只SD大鼠为对照组，行皮肤切开后缝合；剩余50只以Hulth法[3]复制模型。术后予iv青霉素8×104IU·kg-1，每天1次，连续7 d。术后1周将模型大鼠随机分为模型、四环素（50 mg·kg-1）和Fyc高、中、低剂量（2 229.9、743.3、371.65 mg·kg-1）组，ig 给药，每天1次，且每天驱赶大鼠跑步30 min，连续10周。

2.2 观察指标

2.2.1 大体观察关节软骨 软骨标本按以下原则评分：关节面光整，色泽正常（0分）；关节面粗糙，有裂隙，色泽灰暗（1分）；关节面糜烂，软骨缺损达软骨表中层（2分）；关节面溃疡形成，软骨缺损达软骨深层（3分）；软骨剥脱，软骨下骨暴露（4分）。

2.2.2 光镜观察关节软骨 取股骨内髁及胫骨平台软骨标本，4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙2周，常规石蜡包埋，切片，HE染色，依据Mankin’s标准评分。

2.2.3 免疫组化检测IL-6、bFGF蛋白表达 IL-6、bFGF表达按免疫组化试剂盒说明书操作。图像分析：每个标本取4张切片，每张切片随机取5个视野，用北航医学图像分析管理系统测定阳性细胞的百分数。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 大体观察结果

对照组软骨面光滑，呈淡蓝色。模型及各用药组软骨面粗燥，呈淡黄色毛刺状，以模型组最突出，关节腔积液，滑膜显著增生，软骨面可见裂纹、糜烂及溃疡形成，部分溃疡深达软骨下骨。Fyc各剂量组及四环素组损伤较模型组轻。各组关节软骨大体评分结果见表1。

3.2 光镜观察结果及Mankin’s评分

对照组关节软骨结构正常，细胞排列整齐，潮线完整。模型组软骨染色不均，裂隙多，部分深达钙化带，细胞数目减少，排列紊乱，见多重潮线。四环素及Fyc各剂量组Mankin’s评分较模型组低。Mankin’s评分结果见表1。

表1 各组关节软骨大体及Mankin’s评分（±s）Tab 1 Macroscopic grading score and Mankin’s score in each grou（p±s）

表1 各组关节软骨大体及Mankin’s评分（±s）Tab 1 Macroscopic grading score and Mankin’s score in each grou（p±s）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

Mankin’s评分0.2±0.421 8.4±0.966＊4.2±0.918##3.4±0.966##5.9±0.994#7.4±1.173#n组别对照组模型组四环素组Fyc高剂量组Fyc中剂量组Fyc低剂量组10 10 10 10 10 10大体评分0 3.4±0.699＊1.9±0.567##1.7±0.674##2.6±0.699#2.9±0.737

3.3 软骨组织中IL-6和bFGF的表达

3.3.1 IL-6的表达 模型组全层软骨中IL-6表达较对照组显著升高（P＜0.01），各用药组IL-6表达显著低于模型组（P＜0.01）；Fyc高剂量组与四环素组IL-6表达无显著性差异（P＞0.05）。各组关节软骨IL-6表达水平比较见表2。

3.3.2 bFGF的表达 对照组软骨bFGF均匀分布，模型组软骨bFGF表达较对照组高（P＜0.01），各给药组bFGF表达显著高于模型组（P＜0.01）；Fyc高剂量组bFGF表达高于四环素组（P＜0.05）。各组关节软骨bFGF表达水平比较见表2。

表2 各组关节软骨IL-6、bFGF表达水平比较（±s）Tab 2 Expression of IL-6 and bFGF in each group（±s）

表2 各组关节软骨IL-6、bFGF表达水平比较（±s）Tab 2 Expression of IL-6 and bFGF in each group（±s）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

n组别对照组模型组四环素组Fyc高剂量组Fyc中剂量组Fyc低剂量组10 10 10 10 10 10 IL-6表达0.193±0.015 0.336±0.028＊0.250±0.016#0.259±0.014#0.288±0.024#0.299±0.015#bFGF表达0.558±0.018 0.595±0.024＊0.685±0.027#0.738±0.022#0.679±0.024#0.632±0.019#

3.3.3 Pearson相关分析 （1）IL-6与Mankin’s评分：两者相关系数r＝0.963 8，P＜0.01，呈显著正相关；（2）bFGF 与Mankin’s评分：两者相关系数r＝0.154，P＞0.05，无显著相关。IL-6、bFGF表达率与Mankin's评分的相关性见图1。

4 讨论

OA属于中医“痹证”、“骨痹”范畴，其病因病机概括起来，一为因虚致病：肝肾精虚，无以主骨养筋，筋骨失养，风寒湿邪入侵而为痹；二为因病致虚：跌仆闪挫，筋骨劳损，致气虚血瘀，久则肝肾亏损，气血不调，脉络失和而为痹。本病为本虚标实之证，Fyc配伍淫羊霍、鹿角胶、黄芪、川芎、丹参、三七粉等中药，以补肾益气、活血化瘀为法，标本兼治，为临床治疗OA的有效复方。前期研究表明，Fyc可减轻软骨病变，对软骨退变有防治作用。

现代医学认为，OA是多因素共同作用下，软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者间分解和合成代谢失衡的结果。关节软骨退化及破坏是OA的主要病理特征。许多细胞因子及蛋白酶参与了关节软骨降解的发生发展。IL-6是一种多效细胞因子，研究发现，IL-6诱导关节软骨的降解，在骨重建过程中调控骨吸收及生成之间的平衡、诱导MMP-13表达，促进软骨基质中二型胶原的降解[3]。在骨关节炎软骨中IL-6表达显著增加；对体外培养的兔软骨细胞，IL-6可抑制bFGF诱导的细胞集落形成，抑制软骨基质蛋白多糖的合成，并显著增强IL-1β诱导的蛋白多糖降解[4]，提示IL-6是一个软骨细胞增生及关节软骨代谢的负向调节剂。

此外，OA同软骨细胞凋亡与增殖失衡关系密切。大量研究表明，OA患者有典型的软骨细胞凋亡，凋亡数量与OA分级显著相关[5]。bFGF对软骨细胞既是丝裂原又是形态发生因子，对培养的关节软骨细胞增殖及基质代谢有促进作用，随培养基中bFGF的浓度增加，体外培养的软骨细胞DNA含量明显增加。当软骨细胞生长、分裂活跃时，只有存在bFGF，才能维持软骨细胞的表现型。bFGF甚至可将已成熟或转化为成纤维细胞的细胞反分化为软骨细胞[6]。研究表明，关节软骨细胞bFGF-mRNA在兔实验性OA关节软骨原位表达，上调bFGF-mRNA表达，可减轻软骨病变[7]。提示bFGF与OA关系密切。

近年研究发现，四环素类抗生素可抑制基质金属蛋白酶、抑制一氧化氮生成，具有抗炎、免疫调节作用，并可作用于细胞因子网络，其对OA软骨的多途径保护作用已得到证实[8]。本研究采取四环素作为阳性对照，结果发现，IL-6表达与软骨病变相平行，呈显著正相关，Fyc及四环素治疗可降低IL-6表达、减轻软骨病变，提示IL-6可作为OA监测病情严重程度的指标及治疗的作用靶点。Fyc高、中、低剂量组之间，软骨病变的Mankin’s评分差异具有显著性（P＜0.05），随Fyc剂量增加，大鼠OA病变减轻，提示其抗OA作用呈剂量依赖性。Fyc高剂量组bFGF表达显著高于四环素组（P＜0.05），而二者软骨病变、IL-6表达无显著差异，Fyc高剂量组关节软骨局部更高的bFGF水平未产生更强的促细胞增生及基质修复效果，可能提示bFGF对软骨细胞的效应受多种因素影响，在OA治疗中，单纯增加病变关节局部bFGF水平所获得的益处有一定的限度，不能有力阻止疾病进展。骨关节炎为损伤-修复性疾病，软骨基质受损丢失、软骨细胞凋亡及病理性过度修复增生同时存在，治疗中应两个方面同时兼顾。

综上所述，IL-6及bFGF与OA密切相关，可作为治疗的作用靶点。Fyc及四环素通过降低病变局部IL-6表达，上调bFGF表达而减轻OA软骨基质降解，促进损伤修复，可能是其治疗OA的重要机制之一。Fyc抗OA作用呈剂量依赖性，其作为一个疗效肯定、无明显不良反应的抗OA药物，值得进一步临床研究。

[1]王玉彬，陈安民，郭风劲，等.骨关节炎患者软骨组织中TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-9的表达变化及意义[J].山东医药，2007，47（12）：11.

[2]赵承斌，陈 福.rhBMP和bFGF在大鼠关节软骨损伤后的修复作用[J].哈尔滨医科大学学报，2003，37（1）：25.

[3]Legendre F，Dudhia J，Pujol JP，et al.JAK/STAT but not ERK1/ERK2pathway mediates interleukin（IL）-6/soluble IL-6R down-regulation of typeⅡ collagen，aggrec-an core，and link protein transcription in articular chondrocytes：association with a down-regulation of SOX9expression[J].J Biol Chem，2003，278（5）：2 903.

[4]Jikko A，Wakisaka T，Lwamoto M，et al.Effects of interleukin-6 on proliferation and proteoglycan metabolism in articular chondrocyte cultures[J].Cell Biol Int，1998，22（9～10）：615．

[5]Sharif M，Whitehouse A，Sharman P，et al.Increased apoptosis in human osteoarthritis cartilage corresponds to reduced cell density and expression of caspase-3[J].Arthritis Rheum，2004，50（2）：507．

[6]Kato Y，Lwamoto M.Fibroblast growth factor is an inhibitor of chondrencyte terminal differentiation[J].J Biol Chem，1990，265（10）：5 903.

[7]唐 勇，姜 杰，孟 辉，等.补肾益气活血方对兔实验性膝骨关节炎软骨细胞bFGF-mRNA表达的影响[J].云南中医学院学报，2005，28（4）：24.

[8]王 君，何炳书，李笑萍.四环素对负重所致兔膝骨关节损伤的保护作用[J].中国老年学杂志，2007，1（27）：126.

Effects of Fuyuan Capsule on the Expression of Interleukin-6 and Basic Fibroblast Growth Factor in Rats with Experimental Osteoarthritis

LIANG Xiao-fang，LI Rong-heng，TANG Jing（Dept.of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

OBJECTIVE：To observe the effects of Fuyuan capsule on the expression of interleukin-6（IL-6）and basic fibroblast growth factor（bFGF）in rats with experimental osteoarthritis（OA）.METHODS：OA models were induced by Hulth technique.Model rats were randomly divided into six groups：control group，model group，tetracycline group，Fuyuan capsule high-dose，medium-dose and low-dose groups.Those groups were given relevant drug via i.g.gtt once a day for 10 weeks.Articular cartilages were obtained ten weeks later.Histomorphology of cartilage were evaluated according to macroscopic grading score and Mankin’s score was conducted.Expression of IL-6 and bFGF in articular cartilage were detected by immunochistochemistry technology.Pearson correlation analysis was carried out to determine Mankin’s index and the expression of IL-6 and bFGF in articular cartilage.RESULTS：Mankin’s score and the expression of IL-6 in Fuyuan capsule groups were lower than in model group（P＜0.01 orP＜0.05）；the expression level of bFGF in Fuyuan capsule groups were higher than in model group（P＜0.01）；there was significant difference in Mankin’s score among Fuyuan capsule groups（P＜0.05）.Pearson correlation analysis showed that the expression of IL-6 in the articular cartilage was positively correlated with the pathological change of joint（P＜0.01）.There was no significant correlation between the expression of bFGF in the articular cartilage and Mankin’s score.CONCLUSION：Fuyuan capsule can down-regulate the expression of IL-6 and up-regulate the expression of bFGF in dose-dependent manner.The treatment effect of high-dose Fuyuan capsule is identical to tetracycline in the treatment of OA.

Osteoarthritis；Fuyuan capsule；Interleukin-6；Basic fibroblast growth factor

R255.82；R97

A

1001-0408（2010）35-3287-03

2010-05-21

2010-06-08）