唑来膦酸对成骨细胞增殖及IGF-1表达的影响

郑振雨，荆 波，尹芸生

（山西医科大学第二医院骨科，山西太原 030001）

双磷酸盐已经被广泛应用于临床治疗骨代谢疾病，目前大多数实验已经阐明唑来膦酸对破骨细胞的作用机制，但是最近有发生下颌骨坏死的报道，所以其对成骨细胞和成骨质量的影响还存在争议。成骨细胞以自分泌和旁分泌的方式产生IGF-1，它是促进骨合成代谢的主要细胞因子。本实验拟通过观察唑来膦酸对成骨细胞增殖和IGF-1表达的影响，进一步探讨唑来膦酸的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及仪器 唑来膦酸（吉林省西点药业科技发展股份有限公司）；IGF-1酶联免疫试剂盒（美国安迪生物科技有限公司）；MTT（美国Sigma集团公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 成骨细胞培养 取新生24 h内的雄性SD乳鼠（山西医科大学实验动物中心提供）6只。培养方法见参考文献[1]。

1.2.2 实验药物的配制 唑来膦酸粉剂用PBS溶解，制成10-2mol/L作为储备浓度，保存在-20℃冰箱中。用PBS稀释，制成 含药 浓度为 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L 的培 养基。对照组不加药。

1.2.3 MTT法检测成骨细胞增殖 取第三代成骨细胞以每孔5×103个接种于96孔板中，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，改用含有唑来膦酸的DMEM培养基，样本含量为10孔，7d 后，于培养终止前 4h 换液并加入 MTT（5g/L）20 μl，继续培养4 h。吸弃上清液，每孔加入DMSO 100 μl，振荡10 min，490 nm波长下测定个孔吸光度（OD值）。

1.2.4 ELISA检测IGF-1含量 取第三代成骨细胞以每孔3×104个细胞接种于2块24孔板内，样本含量为8孔，于第2天加入含有唑来膦酸的培养液，以后每2天半换液1次，7d时取上清液，按照ELISA试剂盒的说明书进行操作，并计算IGF-1的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 唑来膦酸对成骨细胞增殖的影响

唑来膦酸在较高浓度时（10-4mol/L和10-5mol/L）与对照组相比，成骨细胞数目减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；而在较低浓度时（10-6mol/L和10-7mol/L），与对照组比较，成骨细胞减少不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 唑来膦酸对成骨细胞IGF-1表达的影响

唑来膦酸浓度在10-4、10-5mol/L时IGF-1表达水平低于对照组（P＜0.01）；在浓度为 10-6、10-7mol/L 时，IGF-1 的表达量与对照组相差不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。量与对照组相差不大，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 不同浓度唑来膦酸对成骨细胞增殖（OD值）的影响（±s）Tab.1 Effects of Zeladronate on proliferation(OD value)of osteoblasts(±s)

表1 不同浓度唑来膦酸对成骨细胞增殖（OD值）的影响（±s）Tab.1 Effects of Zeladronate on proliferation(OD value)of osteoblasts(±s)

与对照组相比，*P<0.01，**P>0.05Compared with controlgroup,*P<0.01,**P>0.05

样本量OD值浓度 10-4mol/L 10-5mol/L 10 0.050 ±0.004*10 0.515 ±0.077*10-6mol/L 10 1.293 ±0.138**10-7mol/L 10 1.305 ±0.174**0（对照组）10 1.261 ±0.136

表2 唑来膦酸成骨细胞分泌IGF-1的影响（±s）Tab.2 Effects of Zeladronate on expression of IGF-1 in osteoblasts(±s)

表2 唑来膦酸成骨细胞分泌IGF-1的影响（±s）Tab.2 Effects of Zeladronate on expression of IGF-1 in osteoblasts(±s)

与对照组相比，*P<0.01，**P>0.05Compared with controlgroup,*P<0.01,**P>0.05

样本量IGF-1（μg/L）浓度 10-4mol/L 10-5mol/L 8 11.35 ±3.32*8 20.63 ±5.13*10-6mol/L 8 156.75 ±20.94**10-7mol/L 8 161.31 ±18.57**0（对照组）8 163.17 ±13.26

3 讨论

双磷酸盐被广泛应用于临床治疗骨代谢疾病，例如骨质疏松、Paget病和转移性骨癌[2]。双磷酸盐能促进破骨细胞凋亡[3]，但是最近有使用唑来膦酸后发生下颌骨坏死的报道。所以唑来膦酸对成骨细胞和成骨质量可能也有影响。IGF-1是促进骨合成代谢的主要细胞因子[4]，并且是骨骼中最丰富的生长因子[5]，它能作用于骨质疏松骨愈合的全过程[6]。Hock等[7]研究也发现IGF-1作用于颅盖骨后，胶原合成增加。

本实验结果表明，①唑来膦酸浓度≥10-5mol/L时，IGF-1表达降低，可能是由于其细胞毒性作用引起的。Pan等[8]的报道称，尽管会减少成骨细胞数量，但是高浓度的唑来膦酸（5～25）×10-6mol/L还是会增加人成骨细胞矿化结节的形成。所以，成骨细胞的增殖与矿化关系可能不是那么密切相关。另外，彭晨等[9]的研究显示，唑来膦酸在低浓度时不影响增殖和分化，这支持临床使用低浓度的唑来膦酸。②唑来膦酸浓度在≥10-5mol/L时，抑制成骨细胞增殖，浓度越大，抑制作用越明显。Orriss等[10]研究表明唑来膦酸浓度≥10-9mol/L时对破骨细胞抑制明显。因此，推测该药对破骨细胞的抑制效果比成骨细胞更敏感。这更支持临床使用较低浓度的唑来膦酸。由于在骨微环境中唑来膦酸对成骨细胞的影响至今观点仍不统一[11-12]，而且体内成骨细胞可能较长时间地暴露于唑来膦酸，所以还需要对唑来膦酸的长期作用效果进行深入的研究。

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