微生物筛选法检测辐照食品的研究

赵良娟，郑文杰，张宏伟，李宏虹，赵宏

（天津出入境检验检疫局，天津300201）

微生物筛选法检测辐照食品的研究

赵良娟，郑文杰*，张宏伟，李宏虹，赵宏

（天津出入境检验检疫局，天津300201）

建立一种辐照食品的微生物筛选方法。研究采用细菌内毒素/革兰氏阴性菌微生物筛选法检测不同辐照剂量的鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鱼丸、虾丸、蟹棒、鱿鱼、虾仁，及进出口肉饼、糖果等食品。研究结果，表明该方法具有对多种辐照食品的初筛功能，准确性好，检测灵敏度≥1.5 kGy。细菌内毒素/革兰氏阴性菌微生物初筛法操作简便、快速，可以作为多种辐照食品的初筛鉴别检测方法。

微生物筛选法；辐照食品；革兰氏阴性菌；内毒素

Abstract：To establish microbiological screening method for detection of irradiated food.Endotoxin/Gram negative bacteria microbiological screening method was applied to detect chicken，beef，mutton，pork，fish bolus，shrimp bolus，crab meat sleeve-fish irradiated at different absorbed dose and bakemeat and sugar.The preliminary studies demonstrated that the microbiological screening method can screen the multi-irradiated foods,and have high accuratity and the sensitivity is 1.5 kGy.Endotoxin/Gram negative bacteria microbiological screening method was simple，fast and can be used as screening method to detect the irradiated foods.

Key words:microbiological screening；irradiated foods;Gram negative bacteria(GNB);endotoxin

近年来辐照食品的潜在安全性问题存在争议，尽管在目前允许的食品种类，辐照剂量的作用下的辐照食品是安全的，但不当的辐照会对食品的颜色、味道、营养产生一些副作用，比如脱色、有臭味、破坏一些营养成分，辐照残留也对人的健康存在安全隐患。

而且随着进出口贸易的发展，辐照食品管理中标识的问题已得到欧盟各国及日、韩等国的重视，其影响很可能类似于对转基因食品的要求一样波及全球[1]。目前，美国、英国、德国等国家对食品辐照有比较详细的要求，对于食品种类、辐照剂量、辐照设施、食品辐照的标示都有明确的规定，强调“只有得到许可和经批准的辐照设施才能为特定的目的处理特定的食品”。因此，在日益严峻的食品安全问题和进出口贸易情况下，急需建立辐照食品的鉴别检测技术的研究。

本研究拟建立一个辐照食品的细菌内毒素/革兰氏阴性菌微生物快速筛选方法[2]，为辐照食品的初筛鉴别检测研究提供试验依据，对保证进出口贸易的顺利发展和保障人民的健康具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料与试剂

酪蛋白消化酶、缓冲蛋白胨盐溶液（含有酪蛋白消化酶和氯化钠）、牛奶琼脂培养基、革兰氏阴性菌选择性培养基（含有牛奶琼脂和乳酸链球菌素）：美国BD公司；营养琼脂培养基：北京陆桥公司；结晶紫溶液：天津市佳兴化工工贸有限公司；青霉素G溶液：美国Sigma公司；无内毒素水：美国ACC或厦门鲎试剂厂；内毒素标准品（10 EU/mL）、鲎试剂（灵敏度0.5 EU/mL：规格0.1 mL）：厦门鲎试剂厂；未辐照新鲜鸡肉、牛肉、羊肉、猪肉、鱼丸、虾丸、蟹棒、鱿鱼、虾仁样品：均购自天津菜市场；分别经钴 60 辐照 1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy等8个辐照剂量的鸡肉样品；分别经钴60辐照5 kGy的牛肉、羊肉、猪肉、鱼丸、虾丸、蟹棒、鱿鱼、虾仁样品。

1.1.2 主要仪器与设备

电子天平（感量为0.001 g）：瑞士Mettler Toledo公司；均质器：德国IKA公司；恒温培养箱[（21±1）℃，（37±1）℃]：德国 Memmert公司；微量移液器（20 μL~200 μL，100 μL~1000 μL）：德国 Eppendof公司；无内毒素吸头：美国ACC公司；一次性无菌注射用针筒（100mL）：江西洪达医疗器械公司；无内毒素试管（18mm×180 mm）：美国ACC公司；一次性灭菌培养皿（直径90 mm）：美国Corning公司；parafilm封口膜：美国parafilm公司。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。食品经过一定剂量辐照后，食品中活的革兰氏阴性菌基本上会被杀死，产生大量的细菌内毒素。通过对细菌内毒素的测定和革兰氏阴性菌的培养计数可以估算食品中死的革兰氏阴性菌总数与活的革兰氏阴性菌总数。如果两个结果的差异很大，说明该食品可能经过辐照处理。

1.2.2 样品制备

以无菌操作称取剪碎后的样品10 g，置于装有90 mL无内毒素水的灭菌无内毒素塑料袋（或容器）中，充分振摇、混匀，制成10-1样品匀液，用于革兰氏阴性菌计数和细菌内毒素检测。

1.2.3 革兰氏阴性菌计数

吸取10-1样品匀液1 mL，加入装有9 mL蛋白胨盐溶液的灭菌试管中，制成10-2样品匀液。重复相同操作，到样品被充分稀释（稀释到10-5）。

倾注约10 mL制备好的营养琼脂[保温至（45±1）℃]于培养皿中，水平放置，待其凝固备用。然后分别在已凝固的营养琼脂平板上涂布0.1 mL不同稀释度的样品匀液，每个稀释度涂布两个平板。室温（20℃～25℃）条件下放置90 min。再倾注约10 mL革兰氏阴性菌选择性琼脂[保温至（45±1）℃]于营养琼脂表面。待琼脂凝固后将平皿翻转，（21±1）℃培养（24±1）h。若平板上菌落的直径均＜0.5 mm，该平板应继续培养24 h后再进行计数。

1.2.4 细菌内毒素检测

吸取300 μL 10-1样品匀液，加入装有650 μL无内毒素水的灭菌无内毒素试管中，制成稀释倍数为10-0.5的样品匀液。重复相同操作，将10-0.5的样品匀液依次稀释为10-1.0、10-1.5、10-2.0……直到样品被充分稀释（通常稀释到10-5）。

以内毒素标准品为阳性对照，无内毒素水为阴性对照，分别取0.1 mL不同稀释度的样品匀液加入含有0.1 mL鲎试剂的无内毒素试管中，混合摇匀，用paraflim 封口膜封闭管口，（37±1）℃反应（60±2）min。当试管内的内容物发生完全凝集时为阳性记为“＋”，部分凝集时记为“＋/－”，未凝集时记为“－”。

2 结果与分析

2.1 检测灵敏度

试验以鸡胸肉为例，应用革兰氏阴性菌计数和细菌内毒素筛选法检测未辐照新鲜鸡肉和经钴60辐照1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy等 8 个辐照剂量的鸡胸肉样品，革兰氏阴性菌计数结果和细菌内毒素的检测结果见表1和表2。

表1 不同辐照剂量的鸡胸肉样品革兰氏阴性菌计数结果Table 1 Gram negative bacteria number of different irradiated chicken brests

通过革兰氏阴性菌计数和细菌内毒素检测结果可知，鸡胸肉样品分别经0 kGy（未辐照）和1 kGy辐照后的样品细菌内毒素浓度与革兰氏阴性菌数都很高，log10EU/g-log10cfu GNB/g<0，该剂量辐照样品的检测结果是未辐照样品。而辐照剂量为 1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy时，即当辐照剂量≥1.5 kGy时，log10EU/glog10cfu GNB/g>0，该剂量范围辐照样品检测结果均为疑是辐照样品，需要进一步确证。因此该方法的检测灵敏度≥1.5 kGy。

表2 不同辐照剂量的鸡胸肉样品内毒素检测结果Table 2 Endotoxin of different irradiated chicken breasts

2.2 方法的适用性

试验应用革兰氏阴性菌计数和细菌内毒素筛选法检测未辐照的和分别经钴60辐照5 kGy剂量的新鲜牛肉、羊肉、猪肉、鱼丸、虾丸、蟹棒、鱿鱼、虾仁样品。通过革兰氏阴性菌计数和细菌内毒素检测结果结算得到，牛肉、羊肉、猪肉、鱼丸、虾丸等5种食品的0 kGy（未辐照）样品，log10EU/g-log10cfu GNB/g<0，检测结果为未经辐照样品；羊肉、猪肉、鱼丸、虾丸4种食品5 kGy辐照样品，log10EU/g-log10cfu GNB/g>0，检测结果为疑是辐照样品；牛肉5 kGy辐照样品，细菌内毒素值log10EU/g<2，且革兰氏阴性菌数也很低log10cfu GNB/g<2，检测结果为不可确定。

虾仁、蟹棒和鱿鱼3种食品的0 kGy（未辐照）和5 kGy辐照样品革兰氏阴性菌数很低，几乎为0；且log10EU/g-log10cfu GNB/g均>0，检测结果疑是辐照食品；因此怀疑虾仁、蟹棒和鱿鱼3种食品可能在购买前经过某种方式处理过，可能是辐照。

2.3 自然样品检测

试验中以日常检测的出口猪肉饼20份，凝胶软糖56份为研究对象，通过本方法进行检测，结果如下：猪肉饼18份为疑是辐照样品；凝胶软糖56份均为疑是辐照样品。

因此，研究结果进一步说明通过革兰氏阴性菌/细菌内毒素微生物筛选法能够对肉制品、水产品及日常进出口猪肉饼、凝胶软糖等多种辐照食品的检测，方法具有广泛的适用性。

3 结论

本研究利用内毒素/革兰氏阴性菌微生物筛选法，对 0、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10、15 kGy 等 8 个剂量钴 60辐照过的无皮鸡胸样品、带皮鸡翅样品和带皮鸡腿样品进行辐照检测的初步研究。研究结果表明，该方法具有对辐照鸡肉样品初筛的功能，检测灵敏度≥1.5 kGy。

研究中又对0 kG和5 kGy两个辐照剂量处理的牛肉、羊肉、猪肉、鱼丸、虾丸、蟹棒、鱿鱼、虾仁（购自天津菜市场）进行检测，研究结果进一步说明通过革兰氏阴性菌/细菌内毒素微生物筛选法能够对肉制品、水产品及日常进出口猪肉饼、凝胶软糖等多种辐照食品进行检测，方法具有广泛的适用性。

因此本研究方法可以作为辐照食品的初筛鉴别检测方法，适用于多种辐照食品的初筛检测。

[1]董智挺.我国辐照食品现状及发展对策[J].福建农业科技,2005(4):54-55

[2]EN 14569:2004 Foodstuffs-Microbiological screening for irradiated food using LAL/GNB procedures[s].

Detection of Irradiated Food by Microbiological Screening Method

ZHAO Liang-juan,ZHENG Wen-jie*,ZHANG Hong-wei,LI Hong-hong,ZHAO Hong
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300201,China)

2009-09-14

赵良娟（1979—），女（汉），工程师，硕士研究生，研究方

向：食品安全及微生物检验。

*通信作者：郑文杰（1969—），女（汉），研究员，博士，研究方向：食品安全及分子生物学。