酸根离子对丙酮-丁醇清液发酵的影响

高丽丽,刘佳,朱文众

(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄,050018)

酸根离子对丙酮-丁醇清液发酵的影响

高丽丽,刘佳,朱文众

(河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄,050018)

研究了酸根离子对以玉米淀粉为碳源进行丙酮-丁醇清液发酵时的影响规律。结果表明:抑制作用最强,且随该离子浓度的增加而增强。相对应的钠盐、铵盐质量浓度在0.2～1.0 g/L发酵正常,其中溶剂产量最高达到22.091 g/L,选择合适的浓度能起到一定的促进作用。,Cl-对应盐质量浓度增加到2.0 g/L时,溶剂产量有所下降,另外3种酸根离子的影响作用不大。几种营养盐混合,在不同质量浓度下进行发酵,未添加亚硫酸盐的发酵正常,添加亚硫酸盐的发酵出现异常,溶剂产量很低,仅为1.806 g/L,同样说明对丙酮-丁醇发酵具有强抑制作用。

酸根离子,丙酮-丁醇发酵,清液,玉米淀粉

丙酮-丁醇发酵是一项传统的大宗发酵,历史悠久,被认为是转化生物量为有价值化合物的最有前途的途径之一[1-2]。由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)发酵产生的丁醇、丙酮、乙醇统称为丙丁总溶剂,它是重要的基本有机化工原料,除直接用作溶剂外,还有许多用途[3]。

丙酮、丁醇生产一般利用丙酮丁醇梭菌,在厌氧条件下利用淀粉或糖发酵生成丙酮、丁醇及少量乙醇等溶剂。绝大多数厂家采用玉米或甘薯等淀粉质原料进行发酵,发酵液黏度高,易造成设备堵塞,污染大[4]。原料利用的不充分,导致污水处理成本巨大,发酵产物产量低这一直制约着产业的发展。据报道,在酒精生产中,采用清液发酵,大大优化了酒精的发酵工艺,对原料、水、能源得到全方位的利用,取得了较高的经济效益[5]。清液发酵即对原料进行综合加工,对发酵液中营养成分充分利用,达到发酵液澄清,进而可循环使用,辅助于把发酵液中的营养物质回收利用,进行再生产。采用清液发酵具有诸多优点,例如,便于发酵新技术的应用,改善装置运行状况,发酵液可循环利用,从而实现节能减排等[6]。

试验中配制半合成培养基进行清液发酵,添加营养盐对发酵有显著影响,但是半合成培养基成分复杂,且溶剂产量不高。所以采用玉米淀粉为碳源添加玉米浆进行发酵,验证能否充分利用淀粉从而实现发酵液澄清,但得到的发酵结果不理想,有大量残余淀粉,溶剂产量约为2 g/L。进一步以玉米淀粉为碳源,采用玉米粉浸泡液配制培养基,发酵结果正常,溶剂产量可达21.632 g/L,与以玉米粉为原料的溶剂产量相当。玉米浆与玉米粉浸泡液两者区别主要在于后者浸泡过程中未添加亚硫酸,从而使发酵得到的溶剂产量相差很多。SO2对部分酵母及细菌发酵有抑制作用[7],然而及其他酸根离子对丙酮丁醇梭菌发酵有无影响仍未见报道。

1 材料与方法

1.1 菌种

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)CICC 8011,购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 原料

玉米淀粉,玉米粉(市售)。

1.3 主要仪器

Agilent 6820气相色谱仪,安捷伦科技有限公司;S W-CJ-2FD洁净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;LRH-150B生化培养箱,广东省医疗器械厂。

1.4 工艺流程

将玉米粉加去离子水浸泡24 h后过滤,得到的滤液用于配制质量分数为7%的玉米淀粉醪液,经糊化30 min后分装灭菌,每支试管装液20 mL,待冷却后按10%的接种量接种,然后放入真空干燥器中抽真空后进行厌氧发酵,温度控制在37°C左右,发酵72h后结束,用气相色谱仪对发酵液中的丙酮、丁醇、乙醇的产量进行检测。

玉米粉浸泡过程中,其中的水溶性物质被浸泡出来,浸泡液用于配制玉米淀粉培养基。玉米粉浸泡液与玉米浆的最大区别在于玉米浆中含有SO2,而以玉米淀粉为原料添加玉米浆进行丙丁发酵时,发酵受到抑制,考虑到SO2对一些细菌有抑制作用,可能对丙酮丁醇梭菌也具有抑制作用。另外,用去离子水配制玉米淀粉培养基,由于营养物质不足,发酵失败。所以试验采用玉米粉浸泡液配制玉米淀粉培养基,使玉米淀粉被充分利用,从而实现清液发酵。

1.5 分析方法

1.5.1 产物测定

将发酵液倒入5 mL的离心管中离心(9000 r/min,10 min),取1 mL上清液,加入4 mL内标液,充分摇匀。进样1.0μL进行检测。色谱柱为HP-INNOWAX(19091N-236)毛细管色谱柱(60 m×0.251 mm×0.50μm);检测器为FID;进样温度180°C;检测温度220°C;柱温初始温度70°C,保持1 min后以20°C/min的速率升至130°C,保持1 min后以10°C/min的速率升至170°C,保持1 min后,以5°C/min的速率升至190°C,保持2 min,总运行时间为16 min;载气为氮气90 mL/min;柱流速1 mL/min;氢气30 mL/min;空气300 mL/min;进样量:1.0μL;分流比:90∶1;定性、定量方法:以保留时间定性;内标法定量,内标物为异丁醇。

1.5.2 残余淀粉测定

离心除去清液,在105℃下烘至恒重,称量。

2 结果与讨论

2.1 以玉米粉浸泡液代替去离子水进行丙酮-丁醇发酵

将玉米粉加去离子水于冰箱中浸泡24 h,适当搅拌,过滤后代替去离子水配制培养基进行丙酮-丁醇发酵。分别采用0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g/L的玉米粉浓度进行浸泡,用过滤后的浸泡液配制质量分数为7%的玉米淀粉醪液进行发酵,发酵结果见图1。

由图1可见,随着玉米粉浸泡浓度的增加,溶剂产量先是明显增加,然后基本保持不变。从溶剂产量和节省原料方面考虑,采用2.0g/L的质量浓度浸泡较佳,总溶剂产量达到21.632 g/L,已经达到采用玉米粉为原料发酵的溶剂产量。

2.2 几种常见酸根离子的钠盐对发酵产量的影响

为了研究酸根离子对丙酮-丁醇发酵的影响,首先选择了几种常见酸根离子的钠盐,分别在0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0 g/L的质量浓度下进行发酵,发酵结果见图2。

图1 不同玉米粉浸泡浓度对发酵产量的影响

图2 不同质量浓度下几种钠盐对发酵产量的影响

由图2可见,在Na2SO4,Na2CO3,NaAC,Na3PO4的各个浓度下发酵总溶剂产量均在20 g/L以上,最高溶剂产量可达到22g/L左右,对发酵有一定的促进作用。NaCl质量浓度在0.2～1.0 g/L,发酵正常,但是在2.0 g/L的条件下,溶剂产量仅为12.175 g/L,影响了发酵的正常进行。添加Na2SO3发酵出现异常,质量浓度在0.2 g/L的条件下,溶剂产量为3.947 g/L,并且随着质量浓度地增加溶剂产量降低,在2.0 g/L的质量浓度下,溶剂产量仅为1.558 g/L,很大程度地抑制了发酵。

2.3 添加几种常见酸根离子的铵盐对发酵产量的影响

考虑到Na+对丙酮-丁醇发酵可能也会有影响,所以又选择相对应的几种铵盐,也分别在0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0 g/L的浓度下进行发酵,发酵结果见图3。

由图3可见,铵盐与钠盐的发酵总溶剂变化曲线基本一致。在 0.2～1.0 g/L的质量浓度内,(NH4)2SO4,NH4Cl,(NH4)2CO3,NH4Ac,(NH4)3PO4发酵正常,溶剂产量均在 20 g/L以上,只有(NH4)2SO4在1.0 g/L的质量浓度下溶剂产量为19.846 g/L,略有下降。合适浓度的以上几种铵盐也使产量有所提高,起到了促进作用。(NH4)2CO3,NH4Ac,(NH4)3PO4在2.0 g/L质量浓度下发酵正常,(NH4)2SO4,NH4Cl在此质量浓度下产量降低,分别为13.994 g/L和16.091 g/L。添加(NH4)2SO3与添加Na2SO3变化曲线一致,也出现了发酵异常。质量浓度为0.2 g/L时产量为3.408 g/L,随着浓度增加溶剂产量降低,2.0 g/L质量浓度下(NH4)2SO3溶剂产量仅1.436 g/L,抑制了发酵。

图3 不同质量浓度下几种铵盐对发酵产量的影响

2.4 几种钠盐和铵盐分别混合在不同浓度下对发酵产量的影响

一般几种营养盐都是混合加入培养基,共同发挥作用。因此试验中又分别把几种钠盐和铵盐混合在不同的质量浓度下进行发酵。考虑到亚硫酸盐对发酵有很大的抑制作用,所以又除 Na2SO3和(NH4)2SO3之外将其他几种钠盐和铵盐分别按不同质量浓度混合进行发酵,发酵结果见图4。

图4 各种盐混合在不同质量浓度下对发酵产量的影响

由图4可见,几种盐混合,不添加亚硫酸盐的情况下,发酵正常,最高产率达到22.050 g/L,起到了促进作用;添加亚硫酸盐的发酵出现异常,且亚硫酸盐浓度越大抑制作用越明显,对发酵的影响很大。

2.5 各钠盐在不同质量浓度下的淀粉转化率

添加钠盐与添加铵盐的发酵结果基本一致,选择添加不同钠盐的条件下计算淀粉转化率,见图5。

图5 各钠盐在不同质量浓度下的淀粉转化率

由图5可见,添加Na2SO4,Na2CO3,NaAC,Na3PO4发酵正常,淀粉转化率在30%左右,NaCl质量浓度在2.0 g/L的条件下,淀粉转化率为16.17%,部分淀粉剩余。添加Na2SO3发酵出现异常,淀粉转化率很低,大量淀粉剩余,在2.0 g/L的质量浓度下,淀粉转化率仅为2.18%,而丙丁发酵的理论淀粉转化率为39.2%。从淀粉转化率上同样看出SO32-对丙丁发酵有很强的抑制作用。

3 结论

经多次试验,以玉米淀粉为原料,采用玉米粉浸泡液配制培养基进行清液发酵,溶剂产量可达到21.632 g/L。试验中研究了酸根离子对以玉米淀粉为原料的丙酮-丁醇清液发酵的影响。结果表明:有很强的抑制作用,且随其浓度的增加而增强。对应盐质量浓度在0.2～1.0 g/L,发酵基本正常,溶剂产量均在20 g/L以上,最高达到22.091 g/L,在浓度合适的情况下,这些酸根离子起到了一定的促进作用。当各营养盐质量浓度增加到2.0 g/L时,,Cl-对应的溶剂产量有所下降,另外3种酸根离子影响不大。几种营养盐混合进行发酵,未添加亚硫酸盐的发酵正常,添加亚硫酸盐的发酵出现异常,最低仅为1.806 g/L,同样说明对丙酮-丁醇发酵的强抑制作用。在酿造酒工艺中,SO2的应用广泛,它能够抑制各种微生物的繁殖、发酵。微生物抵抗SO2的能力不一样,细菌最为敏感[8]。试验得出,对丙酮丁醇梭菌也有很强的抑制作用。由此判断,添加玉米浆发酵溶剂产量低,主要原因应该是的影响,可以进一步试验去除玉米浆中的,研究以玉米淀粉为碳源添加玉米浆进行发酵,提高溶剂产量,实现清液发酵。

[1]Rbeck S.Biotechnology:does it have a place in the chemical industry[J].Biotechnol Prog,1985(1):147-150

[2]Chin H L,Chen Z S,Chou C P.Fedbatch operation using Clostridium acetobutylicumsuspension culture as biocatalyst for enhancing hydrogen production[J].Biotechnol Prog,2003:383

[3]成跃祖.总溶剂的发展现状浅析[J].甘肃化工,1994(4):11-13.

[4]能源工程编辑部.玉米发酵法生产丙酮和丁醇成本低[J].能源工程,2008(1):49.

[5]赵紫华,贺达汉.清液酒精发酵与循环式节水工程的研究[J].食品科技,2007(6):86.

[6]云战友,白凤武,冯朴荪.全面认识谷物原料清液发酵生产酒精[J].食品与发酵工业,1997,24(1):67-69.

[7]Thaddeus C.Production of acetone butanol(AB)from liqueWed corn starch,a commercial substrate,usingClostridium beijerinckiicoupled with product recovery by gas stripping[J].Biotechnol Prog,2007,34:771-777.

[8]顾国贤.酿造酒工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,1996:379

ABSTRACTThe clear liquid fermentation hasmany advantages.This paper studies the influential patterns of acid ion on Acetone-butanol clear liquid fermentation with corn starch as carbon source.The results showed that:has the strongest inhibitory ability,and this ability enhances with increasing ion concentration.The fermentation is normalwhen the corresponding concentration of sodium salt,ammonium salt tois in the range of 0.2～1.0 g/L.The highest yield achieved was 22.091g/L.The appropriate concentration can play a certain enzymatic effect.When the concentration corresponding salt of,Cl-increase to 2.0 g/L,the solvent production declined slightly,and there was little effect of the other three acid ion.Mixture of several kinds of salt in the fer mentation at varies concentrations proved that the fermentation was normalwith no sulfite,and itwas abnormal with sulfite,where the solventproductionwas as as1.806g/L.Similarly,strong inhibitory action of SO32-wasproved on the fer mentation.

Key wordsacid ion,Acetone-butanol fermentation,clear liquid,corn starch

Effects of Acid Ion on Acetone-butanol Clear L iquid Fermentation

Gao Li-li,Liu Jia,ZhuWen-zhong
(College of Biological Science and Engineering,HebeiUniversity of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China)

硕士研究生(朱文众教授为通讯作者)。

2009-11-11,改回日期:2010-02-01