PCR法快速检测熟肉制品中肉类来源

孙艳华，张智禹，牛晋阳，李韡，乔建军，*

（1.天津大学化工学院，天津300072;2.天津医科大学基础医学院，天津300070;3.北京市肉类食品监督局，北京100068）

PCR法快速检测熟肉制品中肉类来源

孙艳华1,2，张智禹1，牛晋阳3，李韡1，乔建军1，*

（1.天津大学化工学院，天津300072;2.天津医科大学基础医学院，天津300070;3.北京市肉类食品监督局，北京100068）

应用分子生物学技术进行熟肉制品种类来源的快速检测是目前市场监控方面的空白。通过查阅国内外的相关文献，同时进行基因序列的比对，确定针对市场上常见肉类猪、牛、羊、鸡的特异性线粒体序列的引物。经过多次重复试验证明，所选定的引物只有在同一种属模板DNA存在的情况下才会发生PCR扩增，特异性强，灵敏度高。建立的方法仅需20 mg的样品，而样品中含有1 mg的待检肉类就可以被检出。

熟肉制品；肉类来源；PCR；线粒体DNA

Abstract：It is still empty for rapid detecting meat source from commercial processed meat by using molecular methods.By referring to many literatures and comparing the gene sequences,the characteristic primers for different meat species including sus scrofa,bos taurus,ovis aries,gallus gallus were determined in this paper.By several rounds of experiments,the results of verifications suggested they have high species specificity and can satisfy the requests of accurate detection.Only 20 mg sample was needed for detecting and 1mg meat source in sample could be detected in this paper.

Key words：processed meat;source of meat;PCR;mitochondrial DNA

肉制品市场中，一些单位和个人为了追求自身利益而以鸡肉冒充猪肉，以猪肉冒充牛羊肉等，用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，极大的损坏了消费者的利益和健康[1]。目前，质监部门主要是通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源的判别工作，这些传统鉴别方法对于市场上假冒生肉的鉴别起到了非常重要的作用[2]。但是，对于很多熟肉制品（如香肠）来说，加入的肉经过了粉碎处理，并且添加香料掩盖了原有的味道，传统的方法难以进行准确的肉类来源鉴定。

目前，市场上经过加工的熟肉制品质量难以鉴定，国家及地方各级质监部门急需要一种分析食品中的肉类来源的方法能够快速，有效的对肉类来源进行检测。分析食品中的肉类来源的方法主要有两种：应用抗体特异性的ELISA法和基于核酸特异性的PCR法[3-4]。由于肉制品加工过程中蛋白质容易变性，导致ELISA法鉴定肉类来源的稳定性和可靠性较差。而在食品加工过程中，部分DNA不会被破坏，所以利用PCR方法检测食物中肉类成分是切实可行的方法，该法可以不受肉类高温加工的影响。另外，PCR法具有特异性强、操作简单、灵敏度高的特点，建立的方法由于成本低，也易于快速推广[5]。

基于PCR方法检测饲料和生肉制品中的肉类来源已经得到了较多的关注和研究。1998年，Tartaglia等根据牛线粒体 DNA中的 tRNA3’端、ATPase8和ATPase6的氨基酸片段，设计了特异引物用于检测反刍动物饲料中牛源性成分，建立的方法的检测灵敏度可以达到0.125%[6]。2000年，Montiel-Sosa JF等建立了基于PCR技术的检测肉制品来源的方法，主要用来检测食品中是否有猪肉或猪油[7]。2001年，Lahiff等建立了检测饲料中绵羊、猪和鸡成分的DNA方法，用于反刍动物成分的检测，并且在此基础之上建立了定量PCR分析方法[8-9]。Tajima K等采用分散重复序列（SINE）设计了牛、绵羊和山羊的扩增引物，该引物对以上3种动物成分的检测灵敏度达0.01%[10]。2007年，Tanabe S等采用定量PCR的方法分析食物中猪、鸡、牛、羊及马肉来源，并且可以实现较为准确的定量[11]。

国内陈颖等在检测保健品中牛羊源性成分的过程中使用了PCR方法，所设计的特异性引物对牛成分检测低限为0.05%，甚至可以扩增含有0.005%的山羊成分的样品[12]。杨宝华等应用线粒体DNA的特异性建立分析饲料中蛋白牛羊来源的PCR方法[13]。

通过不同肉类来源的线粒体基因比对，并且查阅国内外的相关文献，确定针对猪、牛、羊、鸡线粒体基因的特异性引物。应用PCR技术进行熟肉制品的肉类来源检测，多次试验证明，建立的方法取样少，所选引物特异性强、灵敏度高。通过对市场上的一些熟肉制品进行随机检测，结果表明大多数正规厂家的熟肉制品的肉类来源基本可靠，只有少数小摊贩的肉类有造假情况。

1 设备与试剂

1.1 试剂与材料

TIANGEN核酸抽提试剂盒、DNA marker（标准分子）、EB（溴化乙锭）染色液、TapDNA酶、PCR试剂盒等均购置北京市天根生物技术有限公司。

1.2 待检测样品

试验中在引物特异性验证过程中和对市场上肉类制品进行检测时用到的猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、火腿肠、香肠及某超市自制的猪肉火腿均从天津超市获得。

1.3 PCR引物的确定

结合现有文献结果，通过分析和比对常见肉类的mtDNA的保守序列，确定了针对不同动物线粒体DNA的特定片段，分别设计不同种属动物引物，见表1。

2 方法

2.1 样品中DNA的提取

将所有样品液氮充分研磨备用，取10 mg～20 mg样品用 200 μL TE 悬浮，加入 400 μL 裂解液（5 mol/L CuSCN；0.05 mol/L Tris-HCl，pH6.4；0.02 mol/L EDTA，pH8.0；1.3%TritonX-100），70 ℃温浴 10 min,加等量氯仿混匀，离心（10000 r/min，5 min），取上层水相，加等量冰乙醇－20℃沉淀 10 min，离心（10000 r/min，5 min），弃上清，用70%乙醇洗涤一次，晾干，用50 μL TE溶解沉淀。-20℃下保存待用。另外，也可以采用染色体DNA提取试剂盒来提取样品的全部DNA。

2.2 PCR试验

将设计好的引物分别与提取到的熟猪肉、熟牛肉、熟羊肉、熟鸡肉DNA进行PCR扩增反应，并对产物进行检测。具体方法如下。

以牛肉DNA与各引物的反应为例。取牛DNA等量加入4个100 μL无菌PCR管中，分别加入牛引物、猪引物、鸡引物和羊引物（正向和反向引物均相等）。在每个PCR管中加入适量含TapDNA酶，dNTPs等的2×master，然后再加入无菌双蒸水稀释。将反应体系放入PCR仪中，设定不同的变性、退火和延伸时间和温度。一般反应的循环参数如表2所示。

表1 不同种属动物的引物Table 1 Primers of different animal species

表2 PCR检测方法的循环参数Table 2 Rameter of PCR method

根据引物，模板及反应体系的不同在具体PCR过程中，循环参数会有轻微的波动。反应完毕后将PCR产物取出，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

3 结果

3.1 引物特异性检测

建立用PCR方法检测熟肉制品中肉类来源的方法，需要对合成的引物进行验证，检测其是否可以通过PCR扩增获得目标条带，同时也需要分析引物的特异性和灵敏度，检测其能否满足检测的需要。提取猪、牛、羊、鸡的染色体，分别用猪、牛、羊、鸡的引物进行PCR，电泳结果如图1所示。

图1（a）为猪、羊染色体分别与猪、羊引物的PCR扩增结果，图（b）为猪、羊、鸡染色体与不同引物的PCR扩增结果，图（c）为牛染色体与不同引物反应的检测结果。

以猪染色体为模板，猪、牛、羊、鸡4种引物为探针进行PCR，扩增结果表明：猪引物与猪染色体可发生PCR扩增（图1-a条带2），而猪染色体与其他3种引物均不能扩增得到目标DNA片段（图1-a条带4；图1-b条带1,2）。

以羊染色体为模板，猪、牛、羊、鸡4种引物为探针进行PCR，扩增结果表明：羊染色体与羊引物可发生PCR扩增（图1-a条带5，7），而羊染色体与其他3种引物均不能扩增得到目标DNA片段（图1-a条带6；图 1-b 条带 3，4）。

以鸡染色体为模板，猪、牛、羊、鸡4种引物为探针进行PCR，扩增结果表明：鸡染色体与鸡引物可发生PCR扩增（图1-b条带5），而鸡染色体与其他3种引物均不能扩增得到目标DNA片段（图1-b条带6，7，8）。

图（c）是针对牛染色体的特异性检测。检测结果可以看出，4种引物中只有牛引物能够以牛染色体为模板发生PCR扩增（图1-c条带1），而其他种属的引物则不能扩增得到目标DNA条带（图1-c条带2,3,4）。

以上结果都说明所设计的猪、牛、羊和鸡引物只有在同源DNA为模板的情况下能够发生PCR扩增，而不与非同源的DNA发生反应，各引物都具有良好的种属特异性。同时，试验中猪染色体含量仅为原有10%时仍然可以获得清楚的检测条带（图1-a条带3），表明此检测方法的灵敏度至少可以达到10%，检测样品为2 mg。另外可以通过染色体DNA浓缩技术进一步提高检测的灵敏度。

3.2 随机检测市场熟肉制品的结果

应用PCR方法检测熟肉制品的特异性好，可以检测到肉类中含量高于10%的造假肉类。购买了正规超市和市场中的10种熟肉制品，用合成的特异引物进行PCR检测，测定结果表明：大多数品牌熟肉制品中的肉类来源与标签中的注明相符。

对某超市自制猪肉制品为阳性对照，提取20 mg样品中的DNA进行PCR扩增，得到了阳性结果（图2条带3），说明此肉制品中确实有一定含量的猪源性成分存在。对A品牌的低端猪肉火腿和某超市自制肉质制品进行检测，结果如图2所示，A品牌猪肉火腿（猪、鸡、鸭混合型）虽然成分中标明含有猪肉成分，但提取的染色体与猪引物进行PCR，却检测不到扩增产物的存在。模板取样增大10倍（条带4）后才可以观察到微弱亮带，表明此混合火腿中猪肉的含量极少。

4 结论

通过比对猪、牛、羊、鸡的线粒体基因组序列，确定了针对4种常见肉类的特异性检测引物。试验证明，获得的引物具有特异性强、灵敏度高的特点，建立的PCR检测方法样品用量少、结果准确，适合大规模推广应用。

由于目前相关法律法规没有明确规定，要求市场上的肉类制品标示出所含肉类的种类及含量，所以市售的肉制品均只标明成分而不标明各成分含量。在这种情况下，对肉制品中不同种属的肉类进行定量检测意义不大，故本试验中所使用的引物其特异性和灵敏度完全符合市场检测的要求。如果未来的实际应用中需要对肉制品的肉类含量进行定量，可以在本文研究基础上开发定量PCR技术，尽管检测成本高，还是可以实现检测的定量化。另外，利用DNA浓缩方法可以进一步提高检测灵敏度，从而实现极微量肉类来源的检测。由于检测极微量肉类来源的实际应用性较低，本文没有添加应用DNA浓缩后提高检测灵敏度的试验结果。同时，基于本文中的PCR方法也可以用于检测食品加工过程中的微生物污染问题[14-15]，同样也是食品安全检测的热点问题。

[1]吴信法.肉的假冒和肉制品掺杂的检验[J].肉品卫生，2002(4):30

[2]林世武,李学花.羊肉和猪肉的快速鉴定方法[J].肉品卫生，2002，(9)：36

[3]彩鸿翔，鲁晓翠，李彬彬，等.酶联免疫吸附技术在食品安全检测中的应用研究进展[J].河北农业科学，2007，11(6)：67-69

[4]Wang R F，Myers M J，Campbell W，et al.A rapid method for PCR detection of bovine materials in animal feedstuffs[J].Molecular and Cellular Probes，2000,14(1):1-5

[5]Erlich H A，Gelfand D，Sninsky J J.Recent advances in the PCR[J].Science，1991，252(5013)：l643-1651

[6]Tartaglia M，Saulle E，Pestalozza S,et al.Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds：a molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials[J].Journal of Food Protection，1998,61(5):513-518

[7]Montiel-Sosa J F,Ruiz-Pesini E,Montoya J,et al.Direct and highly species-specific detection of pork meat and fat in meat products by PCR amplification of mitochondrial DNA[J].J Agric Food Chem,2000,48(7):2829-2832

[8]Lahiff S,Glennon M O B L,Lyng J,et al.Species specific PCR for the identification of ovine,porcine and chicken species in meta and bone meal(MBM)[J].Molecular and cellular probes,2001,15(1):27-35

[9]Lahiff S，Glennon M，Lyng J,et al.Real－time polemerase chain reaction detection of Bovine DNA in meat and bone meal samples[J].Journal of Food Protection,2002，65(7)：1158-1165

[10]Tajima K.PCR detection of DNAs of animal origin in feed by primers based on sequences of short and long interspersed repetitive elements[J].Biosci Biotechnol Biochem,2002,66(10):2247-2250

[11]Tanabe S,Hase M,Yano T,et al.A real-time quantitative PCR detection method for pork,chicken,beef,mutton and horseflesh in foods[J].Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(12):3131-3135

[12]陈颖，吴亚君，徐宝梁，等.进出口动物源性产品中牛羊成分的检测方法[J].食品工业科技,2004,25(8):143-145

[13]杨宝华，宗卉，林庆燕，等.用分子生物学方法鉴别检测动物源性饲料中的牛羊源性成分[J].中国畜牧杂志,2002,38(1):3-5

[14]Aguado V，Vitas A L，Garcia-Jalon.Random amplified polymorphic DNA typing applied to the studies of cross-contamination by Listeria monocytogenesin processed food products[J].Food Protection,2001,64(5):7l6-720

[15]Fach P，Dilasser F，Grout J，et al.Evaluation of PCR based test for detecting salmonella spp in food sample：Probelia Salmonella spp[J].Food Protection,1999,62(12):1387-1393

Rapid Detecting Meat Source in Cooked Meat by PCR Method

SUN Yan-hua1,2,ZHANG Zhi-yu1,NIU Jin-yang3,LI Wei1,QIAO Jian-jun1,*
（1.School of Chemical Engineering＆ Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2.School of Basic Medical Science，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；3.China Meat Research Centre，Beijing 100068，China）

2009-11-23

北京市自然科学基金（6092011）

孙艳华（1972—），女（汉），副教授，在职博士研究生，研究方向：生物检测。

*通讯作者:乔建军（1973—），男（汉），副教授，博士后，研究方向：生物制药。