蚕豆根尖微核实验阳性结果判断标准研究

李 红，丁晓雯，*，石 晶，王海燕

（1.西南大学食品科学学院，重庆400716；2.重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆400716）

蚕豆根尖微核实验阳性结果判断标准研究

李 红1，2，丁晓雯1，2，*，石 晶1，2，王海燕1，2

（1.西南大学食品科学学院，重庆400716；2.重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆400716）

目的：研究蚕豆根尖微核实验阳性结果判断标准。方法：蚕豆根尖微核实验。结果：用方差分析（t检验）比较各致突变物微核率与对照组微核率的差异显著性，提出当微核指数大于1.5时，可以判定实验结果为阳性，即该物质确有致突变性。

蚕豆根尖微核，致突变，微核指数

Abstract：Aim：To study the judgment criterion of positive result in Vicia faba root tips micronucleus test.Methods：Micronucleus test of Vicia faba root tip cells.Conclusions：The analysis of variance（t test）was used to compare the significance of difference between the micro-nucleus rate that measured by these mutagens and the control group，proposing if the micro-nuclear index more than 1.5，then it can be judged the result was the positive result，that is to say，the material did lead to mutation.

Key words：micronucleus of Vicia faba root tips；mutagenicity；micro-nuclear index

蚕豆根尖微核实验是全球公认的环境致突变性检测技术［1］，也是我国环境生物测试的规范方法［2］，目前该实验技术也用于食品遗传作用的评价［3-5］。蚕豆根尖微核实验作为环境致突变性检测技术有其他检测手段无法比拟的很多优点，水质遗传毒性检测中污染指数的引入，很好地避免了因实验条件等因素带来的本底微核率的波动，把微核率与污染程度联系起来，可以直观地根据污染指数（Pollution index，PI）鉴定所测水样的污染程度［6］，准确而快速。但是污染指数只适用于水质污染程度的判断。现在利用蚕豆根尖微核实验检测食品致突变物仍是根据样本组和阴性对照组的微核千分率差异是否具有显著性来判断，不方便而且准确性不够好。所以需要探索建立一个比较合适的、定量的阳性结果判断标准。在食品致突变物的检测中能否像水环境中污染指数一样也引入一个指数，通过这个指数不仅可以避免因实验条件等因素而产生的误差，而且能准确而快速地判定实验结果。微核指数就是在这种思路下提出并探索用于食品中致突变物的判定。环磷酰胺是公认的蚕豆根尖微核实验的标准阳性样本［3，7］，重铬酸钾、叠氮钠、硝酸铅也都有致突变性［8-9］，能诱发蚕豆根尖产生微核，所以本实验用环磷酰胺、重铬酸钾、叠氮钠、硝酸铅四个阳性样本进行蚕豆根尖实验。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蚕豆 购于北碚农贸市场；环磷酰胺 山西普德药业有限公司；叠氮钠（化学纯） 浙江城关化工厂；重铬酸钾 分析纯，重庆北碚化学试剂厂；硝酸铅 分析纯，重庆吉元化学有限公司；碱性品红 分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；卡诺氏固定液 无水乙醇∶冰醋酸=3∶1，自制；本实验所用其它试剂 均为分析纯；水 均为蒸馏水。

显微镜 XSN-3G显微镜，重庆光电仪器有限公司。

1.2 实验方法

蚕豆根尖微核实验方法参照文献［10］。用致突变物环磷酰胺、叠氮钠（NaN3）、重铬酸钾（K2Cr2O7）、硝酸铅（Pb（NO3）2）分别配成不同的浓度梯度，对发芽种子7粒蚕豆根尖进行侵染处理。每个浓度的实验样本吸取20mL于培养皿中，再将发芽蚕豆的根尖放入，使样本液浸泡住根尖5h。然后恢复培养、固定和染色。每组取5条根尖制片，在40倍镜下分别观察1000个细胞，计数微核细胞数。每次实验以蒸馏水作阴性对照，求出微核率和微核指数，计算公式如下：

表1 各种阳性致突变物诱导蚕豆根尖微核率与微核指数

2 结果与讨论

2.1 微核的识别

微核形态为圆形、椭圆形和不规则形的，并与主核分离的小核。微核在嗜色性、折光性、内部结构、边缘光整、所处平面、厚度等方面与主核一致，其直径为主核直径的1/20～1/3。详见图1～图4，箭头所指为微核。

图1 蚕豆根尖微核40倍显微镜下摄片（a）

2.2 不同样本对蚕豆根尖微核率的影响

各种阳性致突变物的微核实验结果见表1。从表1可以看出，用蒸馏水作阴性对照的微核率为8.74‰，符合生物监测规范上提出的本底微核率不超过 10‰ 的要求［2］。

图2 蚕豆根尖微核40倍显微镜下摄片（b）

图3 蚕豆根尖微核100倍油镜下摄片（a）

图4 蚕豆根尖微核100倍油镜下摄片（b）

从表1可以看出，环磷酰胺的致突变性，0.1、1、10、20、50!g/mL的环磷酰胺的微核率均明显高于阴性对照的微核率。经t检验，其P值均小于0.01，能诱发蚕豆根尖细胞微核率的显著提高。表1表明，环磷酰胺在0.1～10!g/mL的范围内与蚕豆根尖微核有明显的剂量效应关系，但20!g/mL以后微核率降低。研究表明，蚕豆根尖细胞也存在应激性，常温下在接触低剂量的诱变因子后，会对更高剂量的诱变因子产生适应性，从而减弱诱变剂对细胞的损伤［11］。所以，环磷酰胺浓度过大可能使蚕豆根尖产生了适应性，反而会抑制微核的产生。但可以肯定，环磷酰胺在一定浓度范围内对蚕豆根尖细胞有致突变的诱导效应。

实验确定0.1～50!g/mL的浓度范围内的重铬酸钾、叠氮钠和0.1～100!g/mL浓度范围内硝酸铅都在蚕豆根尖微核实验中都有一定的致突变性，所以通过本实验进一步验证了其阳性致突变性。

实验结果中当重铬酸钾浓度为0.1!g/mL时微核指数为1.37，差异不显著，硝酸铅浓度为0.1!g/mL时微核指数为1.38，差异显著，可以初步提出微核指数大于1.38时，该化学物质就有致突变性，结果为阳性。但是，综合比较其他实验计算出的微核指数［3-5，8，12］，我们可以谨慎地提出蚕豆根尖微核实验当微核指数大于1.5时，实验结果即为阳性。本研究中也验证了此结果，微核指数在此之上，差异均为极显著，微核实验结果均为阳性。

3 结论

根据以上实验研究结果，提出用蚕豆根尖微核实验测定食品或其他环境中化学物质的致突变性，当微核指数大于1.5时，可以判定实验结果为阳性，即该物质确有致突变性。

［1］GrantW F.Higherplantassaysforthe detection of chromosomal aberrations and gene mutations-a brief historical background on their use for screening and monitoring environmental chemicals［J］.Mutat Res，1999，426：107-112.

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［5］桂明英，郭永红，朱萍，等.美味牛肝菌致突变作用研究［J］.食用菌学报，2008，15（2）：42-46.

［6］陈光荣，金波，李明，等.污染指数在微核技术监测水质污染中的应用［J］.中国环境科学，1986，6（2）：60-63.

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［10］孔志明.环境毒理学［M］.第二版.南京大学出版社，2004：175-178.

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［12］季守莲，钮荣祥，宋正蕊.蚕豆根尖微核技术检测实验室化学毒物的致突变性［J］.中国职业医学，2003，30（5）：68.

Study on judgment criterion of positive result in Vicia Faba root tips micronucleus test

LI Hong1，2，DING Xiao-wen1，2，*，SHI Jing1，2，WANG Hai-yan1，2
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Laboratory of Agricultural Product Processing Technique in Chongqing，Chongqing 400716，China）

TS201.1

A

1002-0306（2010）10-0229-03

2009-09-03 *通讯联系人

李红（1985-），女，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。