山羊SDHD基因cDNA编码序列的克隆与分析

李武峰,岳文斌

(1.山西农业大学 生命科学学院,山西 太谷030801;2.山西农业大学动物科技学院,山西 太谷030801)

在真核细胞和原核细胞线粒体里的三羧酸循 环和电子传递系统中,复合体II,即琥珀酸泛醌氧化还原酶(Succinate-ubiquinone oxidoreductase),又称为琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase),是一个重要的酶复合体。SDHD,即琥珀酸脱氢酶复合体亚基D(Succinate dehydrogenase complex,subunit D)是复合体II的四个亚基(SHDB,SDHC,SDHD和 fumarate hydratase)之一,并且已经发现这些亚基基因的突变与人类的良性肿瘤易患家族有关[1]。

Khatib已经证实牛SD HD等位基因的表达广泛地存在于从牛的胎儿期至成年期的组织中[2]。

Zhu等,从中国通城猪 55天胎儿背最长肌cDNA文库中获得一个SDHDcDNA序列。从中寻找了 SNP后,并进行了关联分析,他们认为SDHD基因型显著与眼肌面积相关(p＜0.05)[3]。

Guimaraes等人的研究认为,SDHD作为生产性状潜在的一个候选基因是由于其在有氧呼吸过程和三羧酸循环中所扮演了一个关键的角色。他们在商品猪群体的背最长肌中检测了SDHDmRNA的表达水平,寻找到3个SNP,并与猪的生长性状、胴体性状和肉品质性状进行了关联分析[4]。

本项研究的目的是为了获取山羊SDHD基因的mRNA序列信息,为进一步研究山羊与肉品质性状的关系打基础。本项研究是对山羊SDHD基因的首次研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究用肝脏和肌肉组织采自黎城种羊场青山羊作为实验材料。刚屠宰的羊,取肝脏和肌肉组织小块用铝箔纸包装后,置-196℃液氮冻存。用TRIzol法从肝脏和肌肉组织中提取总RNA[5]。

1.2 引物设计

选取人(NM_003002)、绵 羊 (NM_001078653)、牛(FJ495085)和猪(NM_001097516)的SDHD基因mRNA序列,利用lasergene 7软件中的SeqMan功能合成一段包含保守片段的序列,并以此序列作为模板设计引物。

再利用Primer3在线设计山羊SDHD基因mRNA序列的特异引物。检查引物的序列落在保守片段内,以保证扩增的成功。本研究用来分离基因片段的引物见表1,引物由北京赛百盛生物技术公司合成。

表1 用于分离和定位山羊的SDHD基因的引物序列Table1 Sequences of primer sets for SDHD geneisolation and mapping

1.3 cDNA第一链的合成

以前述获得的肝脏和肌肉总RNA为模板,利用TaKaRa RNA PCR试剂盒(Ver.3.0)合成cDNA的第一链。10 L反应体系:MgCl22 L,10×RT buffer 1 L,RNase Free d H 2O 3.75 L,dNTP Mixture 1 L,RNase Inhibitor 0.25 L,AMV Reverse Transcriptase 0.5 L,Oligo d T-Adaptor 0.5 L,总RNA 1 L。反应条件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min,共一个循环。

1.4 RT-PCR扩增反应体系及扩增条件

以已经合成的 cDNA第一链为模板,进行PCR扩增,总的反应体系为50 L,其中5×buffer 10 L,10μmol· L-1dNTPs 1 L,10 mol· L-1上游、下游引物各0.5 L,模板 cDNA第一链2 L,TaKaRa Taq HS聚合酶0.25 L,超纯水25.75 L。PCR反应条件:95℃预变性5 min;然后94℃变性30 s,退火30 s,72℃延伸 1～1.5 min,40～42个循环;最后 72℃延伸 10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 产物的纯化、克隆、鉴定和测序

产物的纯化:在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含有目的片段的凝胶,放入1.5 mL的离心管中,然后用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa)纯化PCR产物,按照试剂盒说明书操作。

连接反应:将用PCR产物纯化试剂盒纯化的RT-PCR产物与p MD-19T载体连接。

转化:在5 L的连接产物中加入200 L制备好的感受态细胞,混匀,在冰上放置30 min,42℃热激90 s,其间不要摇动离心管,取出后冰浴5 min,加入800 L无 Amp抗生素的 LB液体培养基,37℃振荡培养 45 min,4 000 r·min-1离心 2 min以收集细胞,在无菌条件下去掉800 L上清液,用余下的200 L液体LB培养基重悬菌液,涂布于已提前涂布了IPTG和X-gal的琼脂平板上,37℃平放30 min后倒置培养过夜。挑取平板上的白斑单菌落,接种于1～1.5 mL含Amp抗生素的液体LB培养基中,37℃300 r·min-1培养过夜。菌液送北京优博奥生物技术有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR产物

用设计的4对引物分别对山羊肝脏和肌肉总RNA进行RT-PCR扩增,所得RT-PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图1、图2和图3。

图1 S1引物的PCR产物Fig.1 PCR products of primer S1.

图2 S2引物的PCR产物Fig.2 PCR products of primer S2.

图 3 S3和S4引物的PCR产物Fig.3 PCR products of primer S3 and S4.

2.2 三段RT-PCR产物的阳性克隆、测序及拼接

由于在PCR扩增中,Taq酶大多在扩增产物的3'-末端非特异性地加上单一的核苷酸A。根据这一特性,本研究采用TaKaRa公司的pMD-19T载体,快速克隆PCR产物。这种载体两端特定地加上一个 T,这样既可以防止载体的自身环化,又为PCR产物提供配对碱基,有效地提高了克隆效率。转化后的大肠杆菌(JM 109)经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,证明为阳性克隆的菌液送北京优博奥生物技术有限公司进行测序。

图1、图 2和图 3 中的 451 bp、420 bp、529 bp和698 bp条带,经同源比对都为目的序列。

所获得的四段序列测序结果经Lasergene7.0软件SeqMan拼接后,获得一条1238 bp长度的序列。

在肝脏和肌肉组织中所获得的实验结果完全相同。说明在山羊SD HD基因mRNA在这两种组织中没有发生选择性剪接,是相同的转录本。

2.3 山羊SDHD基因cDNA编码序列分析

测序获得的山羊SDHD基因1238 bp cDNA编码序列片段,在 GenBank数据库中进行BLAST/nr比对,发现其与绵羊相应序列相似性最高可达98%(NM_001078653),与牛 97%(FJ495085),与猪相应序列相似性达85%(NM_001097516),与人相应序列相似性达81%(NM_003002)。

利用人的SDHD基因mRNA结构作为参考,可以将山羊SDHD基因mRNA序列划分为4个外显子和3个内含子。

用NCBI的ORF Finder软件对已经克隆的山羊SDHD基因cDNA进行开放阅读框分析,发现该序列包含一个480 bp的开放阅读框,两翼有28 bp的5'非翻译区和730 bp的3'非翻译区。开放阅读框编码159氨基酸残基,计算机分析表明(Compute p I/Mw tool),该蛋白的分子量约为17224.11Da,等电点为8.92。通过DNAMAN软件分析发现,山羊SDHD蛋白保守性很高,其与绵羊(Q5G2C6)、牛(ACL82856)、猪(AAW29970)和人(AAH 70307)SDHD蛋白在氨基酸序列上的相似性分别达到 97%、96%、87%和 85%(图4)。根据SDHD蛋白在氨基酸序列的相似性,用 Lasergene7.0软件绘制了该蛋白的系统发育树(图5),结果表明,亲缘关系较近的物种先聚在一起。

图4 山羊SDHD蛋白与人、牛、绵羊和猪蛋白氨基酸序列的比对分析Fig.4 Multiple alignment of the SDHD of goat with those of human,cows,sheep and pigs in amino acids sequences

图5 SDHD蛋白的系统聚类树Fig.5 Phylogenetic tree of the SDHD protein

利用NCBI/CDD对该蛋白的空间结构进行了预测,发现山羊SDHD蛋白含有一个CybS标志性功能区,位于第60～157氨基酸残基。模式图见图6。

图6 SDHD蛋白CybS功能区分布及其三维模式图Fig.6 Three-dimensional ideograph of CybS domain distribution in SDHD protein

3 讨论

由于Guimaraes等(2007)[4]的研究认为猪的SDHD基因可以作为研究猪肉品质性状的候选基因,因此,我们也希望研究山羊SDHD基因作为山羊肉品质性状的候选基因。但是,在NCBI的GenBank中查不到任何山羊SDHD基因的序列作为研究参考,因此,我们首先对山羊SD HD基因mRNA全序列进行了分离克隆,并对其序列进行了相应的分析。

首先利用几个亲缘关系较近物种的同源的序列,构建一段包含若干保守片段的序列。然后利用此虚拟序列进行同源引物的设计。在此项研究中,共设计得到4对引物。

然后利用分子生物技术实验手段,从肝脏和肌肉组织中的总RNA,分别克隆了山羊SD HD基因mRNA 的451 bp、420 bp、529 bp和 698 bp四段段序列,测序结果经SeqMan软件拼接后,结果获得了2条完全相同的1238 bp长度的序列。

此山羊SDHD基因cDNA序列已于2010年1月31日登录在NCBI的GenBank上,登录号为GU338978。

此480 bp的开放阅读框编码159氨基酸残基。

此山羊SD HD蛋白质序列也于2010年1月31日登录在 NCBI的 GenBank上,登录号为ADB92501。

本项研究为进一步研究山羊的SDHD基因作为山羊肉品质性状候选基因,提供了相应的序列信息。

[1]Gottlieb E,Tomlinson I P M.Mitochondrial tumour suppressors:a genetic and biochemical update[J].Nature Reviews Cancer,2005(5):857-866.

[2]Khatib H.The COPG2,DCN and SDHD genes are biallelically ex pressed in cattle[J].Mammalian Genome,2005(16):545-552.

[3]Zhu Z M,Zhang J B,Zhao S H.Cloning,mapping and association study with carcass traits of the porcine SDHD gene[J].Animal Genetics,2005(36):191-195.

[4]Guimaraes S E F,Rothschild M F,Ciobanu D,et al.SNP discovery,expression and association analy sis for the SDHD gene inpigs[J].Journal of Animal Breeding and Genetics,2007(124):246-253.

[5]周正奎,姬爱国,马腾壑,等.牛组织高质量总RNA和m RNA的提取[J].中国草食动物,2008,28(1):30-32.