青蛤POD组织差异及温度骤升和窒息胁迫对青蛤POD的影响

李晓英，董志国,，阎斌伦，程汉良，孟学平，沈和定，李家乐

（1.淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005；2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306）

青蛤POD组织差异及温度骤升和窒息胁迫对青蛤POD的影响

李晓英1，董志国1,2，阎斌伦1，程汉良1，孟学平1，沈和定2，李家乐2

（1.淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005；2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306）

研究了青蛤肝胰腺、鳃瓣、斧足、外套膜组织中过氧化物酶（POD）组织差异以及温度骤升和窒息胁迫对青蛤POD酶活的影响。结果表明：水温16℃和温度骤升至32℃环境下青蛤POD酶活性均存在不同程度的组织差异性，且以肝胰腺中的POD活性最高，而斧足最低。水温16℃环境下青蛤的肝胰腺、斧足、外套膜和鳃瓣这4个组织之间的POD酶活力除外套膜和鳃瓣无显著差异外，其余均存在明显的组织差异（P＜0.05）,其中肝胰腺的POD酶活最高1.68±0.08 U·mg-1，其次为鳃瓣、外套膜，而斧足中的POD活力最低0.19±0.02 U·mg-1。同时温度骤升胁迫对青蛤的POD也有显著的影响，在瞬时32℃高温下5 h时肝胰腺的POD酶活达到最大值3.85±0.06U·mg-1，11 h时出现第二峰值3.47±0.22 U·mg-1，15 h后POD值达到处理前水平并逐渐趋于稳定；在窒息环境胁迫下肝胰腺的POD酶活在15 h内变化无显著变化，与对照组水平接近，15 h-17 h酶活显著升高，17 h达到最大值2.98±0.54 U·mg-1，之后又恢复到对照组水平。

青蛤；温度骤升；窒息；过氧化物酶；组织差异

Abstract：The Peroxidase (POD)activity differences were comparatively studied in the four tissues,hepatopancreas,gill,foot and mantle of C.sinensis as well as the impact of sharp increase in water temperature and hypoxia on POD activity for the clam.The results showed that,either in 16℃ sea water or sharp increase to 32 ℃,there existed significant differences in specific activity of POD among four organs of the clam (P＜0.05,except between hepatopancreas and mantle).The POD had the highest activity1.68±0.08 U·mg-1in hepatopancreas while lowest 0.19±0.02 U·mg-1in foot in 16 ℃ sea water.After the increment of temperature to 32 ℃,the activity of POD amounted to the maximum of 3.85±0.06U·mg-1in 5 h and then declined,until 11h,the second peak of 3.47±0.22 U·mg-1appeared,and after that,the value recovered to untreated level and kept stable.Under the conditions of hypoxia,the activity of POD had no change in 15 h then sharply rose in 15 h-17 h and finally amounted to maximum of 2.98±0.54 U·mg-1in 17 h and later it returned to the level of control group.

Keywords：Cyclina sinensis; temperature increment; hypoxia; Peroxidase; tissue differences

贝类具有低等的免疫功能，主要通过细胞免疫和体液免疫来完成其免疫机制，而环境因子对贝类的抗氧化免疫酶活性有着显著的影响，这在贻贝(Mytilus galloprovincialis)[1]、棕蚌(Perna perna)[2]和岩牡蛎(Saccostrea glomerata)[3]等得到了印证。过氧化物酶（POD）广泛存在于动植物和微生物细胞的过氧化物酶体中。在动物中，过氧化物酶与吞噬功能和免疫细胞功能相伴[4-6]，起细胞黏附[7]、抗氧化[8-10]和氧化聚合对苯二酚成黑色素的功能[11]，在底栖海洋无脊椎动物中如贻贝和蛤类，过氧化物酶是主要的免疫酶类参与免疫调节[12-14]。

青蛤(Cyclina sinensis Gmelin)属于瓣鳃纲(Lamelliranchia)、帘蛤科(Veneridae)，俗称黑蛤、蛤蜊等，为暖水性亚热带种类，是中国沿海重要的经济贝类。青蛤的研究目前主要集中在繁殖与发育生物学[15-17]、遗传[18,19]和生态[20,21]等研究方面。作者先后利用温度骤升和窒息胁迫这两个环境因子对青蛤免疫相关抗氧化酶类酸性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSZ ）、超氧化物歧化酶（SOD）以及过氧化氢酶（CAT）的影响开展了研究[22,23]，而POD作为重要的抗氧化酶类在海洋贝类的组织器官分布规律和环境因子对其影响程度均未见相关报道。青蛤作为一种滩涂埋栖贝类，受潮汐规律影响，形成特殊的生态环境，特别是潮水涨落形成的栖息地环境温度和溶解氧的显著变化成为滩涂贝类的最主要生态因子；加之作为经济贝类，青蛤长途运输中温度和氧气成为其存活的关键因子。因此，从免疫水平上揭示高温和低氧环境对青蛤过氧化物酶的作用规律，查明其组织分布规律，对于青蛤的免疫生理、种质鉴定、滩涂养殖生态学和活体运输保存等均具有重要的科学意义和实践意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用青蛤为2008年5月取自连云港海区的自然群体，选取个体规格基本一致2龄蛤100枚，壳长（29.32±2.53）mm。采集到的青蛤活体快速运到实验室后暂养于水产养殖控温循环系统内（大连汇新公司），自然海水控温16℃,盐度 23，水槽中铺沙4-5 cm，连续充气不投饵，适应7 d后开始试验。

1.2 酶液的制备

组织差异试验中青蛤每个处理取 5枚，准确分离肝胰腺、外套膜、斧足、鳃瓣，液氮中研磨呈粉状，粉状组织转移入2 ml的离心管内，称重。加冷生理盐水，体积为组织块重量的9倍，将制备好的10% 匀浆在高速冷冻离心机 12 000 r/min离心10 min。取上清液进行测定或放于 -20℃保存备用。

1.3 试验条件的设定

1.3.1 温度骤升 取暂养青蛤的海水，利用加热棒和控温仪加热海水并维持在 32 ℃，随机选取暂养的青蛤，分别处理3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h、15 h、24 h，以未作处理的青蛤为对照。试验期间的其它环境条件、饲养管理同暂养期。达到试验时间后，每个处理时间随机选取5个样本提取酶液。

1.3.2 窒息条件处理 加热煮沸海水，维持沸腾状态，直至将海水中的气泡驱除干净。迅速用液体石蜡封住液面，将实验海水与空气隔离，使海水中溶氧始终保持在低氧水平。经碘量法测定溶氧低于0.2 mg·L-1。利用冷水浴将实验海水冷却并保持在16 ℃。随机选取暂养的青蛤轻轻放入，注意保持液面封闭，分别处理3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h、15 h、17 h、19 h、23 h、27 h，以未作处理的青蛤为对照。试验期间除停止充气外，其它环境条件、饲养管理同暂养期。达到试验时间后随机选取5个样本提取酶液。

1.4 测定指标及方法

POD的测定采愈创木酚法[24]。1 mL酶液在1 min内氧化物1 μg愈创木酚为1个酶的活力单位，以上测定均按试剂盒（南京建成生物研究所）说明书进行。

1.5 数据处理

将结果输入 MS-Excel 2003 进行计算并绘制曲线，采用STATISTICA 5.5统计软件对数据进行单因素方差分析，并进行Tukey HSD多重比较。

2 结果与分析

2.1 青蛤4组织中过氧化物酶活性表达差异

青蛤4种组织中POD酶活结果见图1。由图可知青蛤在未受高温应激处理前，即对照组（16 ℃）青蛤的肝胰腺、斧足、外套膜和鳃瓣在4组织中的POD酶活力除外套膜和鳃瓣无显著差异外，其余均存在明显的组织差异（P＜ 0.05），其中肝胰腺的POD酶活最高1.68 ± 0.08 U·mg-1，其次为鳃瓣、外套膜，而斧足中的 POD活力最低 0.19 ± 0.02 U·mg-1；而试验组青蛤在32 ℃高温下应激3 h后，4组织中POD活力大小关系基本与对照组的一致。仍然是肝胰腺的 POD 酶活力最高达 2.33 ± 0.12 U·mg-1，斧足依然为最低0.10 ± 0.01 U·mg-1。因此，常温和高温应激条件下青蛤 POD存在明显的组织差异性，且以肝胰腺中的POD活性最高，而斧足最低。

2.2 温度骤升对青蛤POD的影响

将青蛤由水温16 ℃的环境下瞬时置于32 ℃的水环境中，不同处理时间组POD的酶活结果见图2。由图2可见青蛤在32 ℃水中经过不同时间的高温处理，其肝胰腺中过氧化物酶的活性发生了明显的变化。其中高温处理5 h时过氧化物酶的活性达到最大值3.85 ± 0.06 U·mg-1，5 h之后出现明显下降，一直持续到 9 h，11 h时出现第二峰值3.47±0.22 U·mg-1，之后逐渐下降，恢复至初始值。方差分析结果表明，在 24 h内，有高温应激处理5 h和 11 h达到最大峰值，二者无明显差异（P＞0.05），而与其它时间内的POD酶活均存在显著差异。需要指出的是除5 h和11 h 这两个时间的酶活力达到最大，7-9 h处于过渡期或波动期，其余时间的 POD酶活基本上维持在初始状态，酶活无显著差异（P ＞ 0.05）。从起始到5 h间过氧化物酶的活性显著增高，表现出高温胁迫引起青蛤肝胰腺中过氧化物酶的大量表达，并在11 h达到最大后在13 h恢复到试验前的水平，表现出青蛤对高温的逐渐适应性。

图1 青蛤POD酶活的组织差异Fig.1 POD activity in four organs of C.sinensis

2.3 低氧窒息环境对青蛤过氧化物酶的影响

青蛤由正常条件下（水温16℃，连续充氧）瞬时置于无氧窒息水环境中，不同处理时间组 POD的酶活结果见图3。由图3可见经过不同时间的低氧处理，青蛤肝胰腺中的POD酶活在17 h时极剧增加达到了最大值 2.98 ± 0.54 U·mg-1，从处于窒息状况起始到 15 h之间 POD酶活无明显变化(P ＞0.05)，酶活与对照组水平接近(图3中的0 h值)，15 h到17 h间POD酶活显著升高（与其它时刻均为P ＜ 0.05），表现出窒息条件胁迫下机体POD的生理功能。17 h之后POD酶活出现下降回到与对照组相同的水平（POD酶活在19 h后与15 h前的相同均为P ＞ 0.05）。上述结果说明青蛤受到低氧窒息胁迫时在一定程度上机体可以表现出明显的抗性，而持续一段时间后则又表现出很强的适应性，机体POD酶活又恢复到正常水平。

图2 温度骤升后青蛤肝胰腺POD的酶活性Fig.2 POD activity of hepatopancreas after sharp increase of temperature

图3 窒息条件下青蛤肝胰腺POD酶活Fig.3 POD activity of hepatopancreas in suffocation state

3 讨 论

3.1 青蛤4组织中过氧化物酶的组织差异

一些免疫酶类常具有组织表达差异，作为生化遗传标记在种质鉴定和遗传结构分析中发挥了重要的作用，如 SOD[25]，POD[26]等。本研究结果显示POD在青蛤4组织中存在酶活差异，常温和高温应激条件下均存在明显的组织差异性。青蛤在未受高温应激处理前，肝胰腺、斧足、外套膜和鳃瓣这4个组织之间的POD酶活力以肝胰腺活力最高为1.63 ± 0.08 U·mg-1，其次为鳃瓣、外套膜，而斧足中的过氧化物酶活力最低为0.19 ± 0.02 U·mg-1；青蛤在32 ℃高温下应激3 h后，其4个组织中POD活力仍然存在明显的组织差异（P ＜ 0.05），其中肝胰腺的POD 活力仍然最高为 2.38 ± 0.12 U·mg-1。因此，过氧化物酶在青蛤中存在明显的组织差异性，且它的活力在肝胰腺中最高，这可能与不同组织器官生理功能不同有关。杨军峰等（2007）[27]在对斑鳜和翘嘴鳜不同组织中过氧化物酶的比较研究实验中发现，POD具有种间特异性，可以作为鳜鱼分类鉴定的依据，同时也具有组织特异性，经电泳结果分析过氧化物酶在鱼体不同组织里表达的差异比较明显（肝脏、肾、脑等），这与本论文的研究结果具有一定的相似性。一般双壳贝类的肝胰腺主要作为消化器官，内有大量的酶类，可能也是主要的免疫酶的产生器官。这种表达差异可以作为双壳贝类的一个典型的生理生化指标，进一步开展青蛤生理生态研究，将肝胰腺组织作为研究环境胁迫对青蛤过氧化物酶影响目标组织器官具有一定的可行性。

3.2 高温与低氧环境胁迫对青蛤过氧化物酶的影响

过氧化物酶（POD）在自然界中广泛分布，在动物、植物、微生物中都扮演着重要的角色，它也是动植物细胞内保护酶系统中的一种，与动植物抵御极端温度、干旱、重金属胁迫、病害等各种不良环境有着密切的关系。POD活性变化作为生物体内重要的生理指标，同时也是生物响应逆境环境的重要标志，可以作为监测环境胁迫的生物指标[28]。对于 POD的组织差异及其影响其活性的因素研究在海洋生物如鱼类和虾蟹类中研究较少，相关研究仅见H2O2、pH、硫氧嘧啶、氰化物因子对攀鲈（Anabas testudineus ）头肾中体外环境下 POD活性影响的研究，结果显示单独将H2O2量达到1.2 µmoles/混合液,或者pH为5.5时酶活均达最高值，而硫氧嘧啶、氰化物均有抑制作用[29]。本研究测定了高温和低氧条件下 POD在青蛤体内环境下活性的变化，结果表明，青蛤在受到高温和低氧等环境胁迫后，分别在0 h到5 h和0 h到17 h内均出现过氧化物酶活力的显著提高，体现了环境胁迫对过氧化物酶的影响。刘应迪(2001)研究了湿地匍灯藓（Plagiomium acutum）和大羽藓（Thuidium cymbifolium）在不同的高温胁迫条件下 POD活性及其与处理时间和处理温度的关系，结果表明，在一定的温度范围内，随着温度的升高，POD活性增加。在一定温度条件下，一般随着处理时间的延长，POD活性增加。但是当超过一定的温度（45-50℃）以及一定的处理时间（4-6 h），POD活性有所下降[30]。对另一植物文冠果（Xanthoceras Sorbifolia）的研究认为 POD酶活性上升是在高温胁迫下细胞受损，组织细胞活性氧的产生和消除的平衡被打破，使得活性氧产量增加[31]。对龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）研究发现温度的上升既可引起活体内 POD酶活力的上升，也可明显提高提纯后的离体POD酶活力，表明龙须菜POD对温度的响应既可能是基因转录水平上对酶蛋白合成的诱导，也可以直接作用于蛋白质水平上，引起酶蛋白高级结构的变化从而导致活力的上升，因此龙须菜 POD对温度胁迫表现出了非常特殊的响应[28]。上述对植物研究结果与本试验的结果有一些相似之处，但也存在了一些不同现象。青蛤在32 ℃高温胁迫下在5 h时达到最大值之后逐渐下降，到9 h时又出现上升趋势，11 h时出现第二峰值，之后再次下降，15 h时过氧化物酶的活性基本恢复，达到对照组水平，之后逐渐趋于稳定。青蛤在 11 h时出现第二次峰值，之后再次下降并趋于平稳，第二个峰值现象的出现我们推测可能是青蛤长时间在高温胁迫下生命降低前所做的“垂死挣扎”。这种情况在徐钢春（2007）研究环境胁迫对河蚬(Corbicula fluminea)酶活性影响所得结果类似[32]。本试验中在低氧环境下青蛤在0 h到15 h之间过氧化物酶的活性与对照组水平接近，比较平稳，而15 h到17 h间过氧化物酶的活性显著升高，表现出低氧条件对过氧化物酶的诱导作用，17 h之后过氧化物酶的活性出现下降，表现出低氧的抑制作用。在低氧环境下过氧化物酶在15 h时才开始上升并在17 h时达到最高，这与在高温环境 5 h就出现最高值相比推迟了很多，可能是在低氧环境下过氧化物酶对环境的反应能力较迟缓。

相对于文蛤和杂色蛤子等帘蛤科经济种类，青蛤一般被认为具有较强的环境耐受力，水体温度和溶解氧含量等环境因子在一定的阈值范围内不会对青蛤的生命构成威胁，但在不良环境因子长时间存在或当环境突然恶化时，很可能会使群体的适应力有所降低。本研究结果提示青蛤养殖、育种保种研究中尽量保持环境的相对稳定，以免温度及溶氧大幅度变化引起青蛤 POD产生明显的波动，导致机体产生剧烈的反应，影响自身的生存。

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Differences of peroxidase activity in four organs and the impact of sharp temperature increase and hypoxia on peroxidase activity in Cyclina sinensis

LI Xiao-ying1,DONG Zhi-guo1,2,YAN Bin-lun1,CHENG Han-liang1,MENG Xue-ping1，SHEN He-ding2，LI Jia-le2

(1.Key Laboratory of Marine Biotechnology of Jiangsu Province,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.Aquatic and Life School,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Q554+.6; Q959.215

A

1001-6932(2010)05-0521-05

2009-08-18；

2010-02-08

农业部水产种质资源与利用重点开放实验室开放课题基金（KFT2008—4），江苏省海洋生物技术重点实验室项目（HS2007004）和连云港市科技发展计划（科技攻关 CN0906）项目共同资助

李晓英 (1975－ )，女，硕士，实验师，主要从事水产种质资源与种苗工程研究。电子邮箱：dzg7712@sina.com.cn

李家乐，电子邮箱：jlli@shou.edu.cn