A TM mRNA在食管癌组织中的表达及其临床意义

江 燕 尹 玉 曹立宇张洪福 潘美华

(安徽医科大学病理教研室,合肥 230032)

A TM mRNA在食管癌组织中的表达及其临床意义

江 燕 尹 玉 曹立宇＊张洪福 潘美华

(安徽医科大学病理教研室,合肥 230032)

目的 探讨共济失调性毛细血管扩张症突变基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM)mRNA在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义。方法 应用原位分子杂交方法检测52例食管正常黏膜、45例食管上皮内瘤变组织及63例食管癌组织ATM mRNA的表达。结果 食管正常黏膜、食管上皮内瘤变及食管癌组织中ATM mRNA表达率分别为26.9%(14/52)、44.4%(20/45)及63.5%(40/63),食管癌组织中ATM mRNA表达率明显高于正常黏膜及上皮内瘤变(P≤0.05),ATM mRNA表达率与食管癌组织分级呈负相关(r=-0.312,P=0.013);食管正常黏膜和食管上皮内瘤变ATM mRNA表达率无明显差异(P=0.07),食管癌组织中ATM mRNA表达与患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期及其它临床病理因素无关(P>0.05)。结论 ATM mRNA在食管癌组织中异常表达,有望成为食管癌治疗的新靶点。

食道肿瘤;鳞状细胞癌;ATM;原位杂交

食管癌是我国常见的恶性肿瘤,严重威胁人类健康,如何早期诊断和个体化治疗食管癌倍受肿瘤科医生关注。共济失调性毛细血管扩张症(ataxiatelangiectasia,AT)是一种罕见的常染色体隐性遗传病,其主要临床表现为进行性小脑共济失调,眼和面部皮肤的毛细血管扩张,肺部反复感染,性腺发育异常,对辐射高度敏感,肿瘤易发倾向,染色体不稳定性,免疫缺陷和抗射线的DNA复制合成等[1],1957年被确认为单基因遗传性疾病,其致病基因为 A TM(ataxia-telangiectasia mutant)基。本研究利用原位分子杂交方法检测A TM mRNA在食管正常黏膜、食管上皮内瘤变和食管癌组织中的表达情况,为临床食管癌的放射增敏治疗提供新的治疗靶点及理论依据。

材料和方法

1.研究对象 收集安徽医科大学第一附属医院病理科2004年3月-2005年6月间住院食管癌手术切除标本63例,其中男性48例、女性15例;年龄38-82岁、平均年龄61.2岁。术后病理诊断为食管鳞状细胞癌。上段食管癌5例,中段食管癌48例,下段食管癌10例;溃疡型57例,蕈伞型5例,髓质型1例。按组织学分级:高分化组20例、中分化组27例、低分化组16例;按国际抗癌联合会(UICC)1997年标准临床病理分期:Ⅰ期癌2例、Ⅱ期癌46例、Ⅲ+IV期癌15例。19例有淋巴结转移,44例无淋巴结转移。所有标本均经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm连续切片,分别做HE染色和原位分子杂交染色。另取52例距癌灶边缘5cm以上切缘的正常黏膜组织和45例内窥镜活检食管上皮内瘤变标本作为对照。所有患者术前未经放疗、化疗及免疫治疗。

2.试剂来源 ATM cDNA p GEM5zf(+)-重组质粒由美国德克萨斯州 U T M.D.Anderson Cancer Center的徐晓春博士惠赠,RNase A和限制性内切酶 EcoR I购自华美生物工程公司,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京道普生物技术公司,DNA探针标记和检测试剂盒 I、原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司, DEPC由美国Sigma公司生产,DAB显色试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

3.试验方法

3.1 制备Dig-A TM cDNA探针 用碱裂解法[2]提取A TM cDNA p GEM5zf(+)-重组质粒。用限制性内切酶EcoR I酶切重组质粒后电泳,按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明对ATM cDNA进行回收,然后按DNA探针标记和检测试剂盒I说明对A TM cDNA进行标记。经斑点杂交鉴定检测探针灵敏度。

3.2 原位杂交 石蜡切片复温,常规脱蜡至水,3%H2O2室温处理10min,3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶37℃消化20min,4%多聚甲醛室温固定5min,滴加预杂交液20μl,恒温箱内预杂交4h,滴加热变性的杂交液50μl,42℃杂交过夜,洗涤,滴加封闭液室温20min,滴加兔抗地高辛,37℃孵育60min,滴加生物素化羊抗兔 IgG,37℃孵育30min,0.5mol/LPBS洗涤,DAB显色,充分水洗,苏木素复染,脱水,透明,中性树胶封片。

原位杂交阳性结果的判断ATM mRNA原位杂交阳性信号为黄色或棕黄色颗粒,定位于细胞质中。在高倍镜下,400×光学显微镜下每张切片至少计数10个视野,每个视野100个细胞,取阳性细胞百分比的平均值[3]:阳性细胞数<10%或无阳性着色为阴性(-),11%-50%为弱阳性(+), 51%-75%为阳性(++),>75%为强阳性(++ +)。

4.统计方法

应用SPSS 11.0统计分析软件包,计数资料中率的差异性使用χ2检验或Fisher’s精确概率检验,等级资料的相关性分析用非参数spearman等级相关检验。

结 果

1.ATM mRNA在食管正常黏膜、食管上皮内瘤变及食管癌中的表达 ATM mRNA原位杂交阳性信号为黄色或棕黄色颗粒,定位于细胞质中。ATM mRNA食管正常黏膜中表达微弱或无表达(图A),而在食管鳞状细胞癌和食管上皮内瘤变中ATM mRNA表达增高(图B,C,D),食管正常黏膜、食管上皮内瘤变及食管癌组织中A TM mRNA表达率分别为26.9%(14/52)、44.4%(20/ 45)及63.5%(40/63)(见表1)。ATM mRNA在食管癌组织中的表达高于食管正常黏膜及食管上皮内瘤变(P≤0.05),ATM mRNA在食管上皮内瘤变中的表达高于食管正常黏膜,但无统计学意义(P=0.07)。

表1 ATM mRNA在食管正常黏膜、上皮内瘤变和鳞状细胞癌中的表达Table 1 Expressions of ATM mRNA in normal esophageal mucosa,intraepithelial neoplasia and squamous cell carcinoma

2.ATM mRNA表达与食管癌临床病理参数的关系 ATM mRNA在63例食管癌组织中的表达见表2。ATM mRNA在高、中、低分化鳞状细胞癌组中的表达分别为45.0%、66.7%和81.3%,高、中分化组ATM mRNA表达率无差别(P= 0.099),低分化组ATM mRNA表达率显著高于高分化组(P=0.020)。随着组织分级越差, ATM mRNA表达呈增高趋势,ATM mRNA的表达同肿瘤组织分级之间呈负相关(r=-0.312,P =0.013)。ATM mRNA表达与患者年龄、性别、临床分期、淋巴结转移、肿瘤大小以及肿瘤的位置无关(P值分别为0.980、0.121、1.000、0.544、0.090以及1.000)。

表2 ATM mRNA表达与食管癌临床病理因素的关系Table 2 The relationship of ATM mRNA expression and clinicopathological manifestations in esophageal squamous cell carcinoma

讨 论

我国食管癌发病率较高,早期食管癌以手术治疗为主,中晚期食管癌由于失去最佳手术机会,以放射治疗为主,多年临床研究显示单纯放疗效果不佳,肿瘤易复发和转移[4]。

A TM基因位于11q22-23,全长约150kb,编码序列约12kb,由66个外显子组成,ATM基因是对DNA双链断裂应答的主要调控因子,对维持染色体的稳定性和防止细胞癌变起重要作用。当ATM基因发生突变、失活和功能受损后,可以导致细胞周期阻滞现象减弱、DNA双链断裂修复障碍以及基因不稳定性的增加,从而出现对放射的高度敏感和肿瘤易发倾向[1]。

李高峰等[5]通过RT-PCR检测发现在原发性肝癌患者血清中A TM的表达率较正常人高;Albrecht等[6]用队列比较基因组杂交研究显示,Barrett’s食管腺癌ATM基因表达增高,我们首次用原位分子杂交法对食管正常黏膜、食管上皮内瘤变和食管癌组织中ATM mRNA进行了检测,实验结果显示,食管正常黏膜、食管上皮内瘤变及食管癌组织中 ATM mRNA表达率分别为26.9%(14/52)、44.4%(20/45)及 63.5%(40/63),ATM mRNA在食管癌组织中的表达高于食管正常黏膜及食管上皮内瘤变(P≤0.05), ATM mRNA在食管上皮内瘤变中的表达高于食管正常黏膜,但无统计学意义(P=0.07),说明ATM表达异常与食管癌发生有关,但它在食管癌发病机制中是否起十分重要作用,还需深入研究。本实验结果还显示ATM mRNA在高分化鳞状细胞癌中的表达率(45.0%)明显低于低分化鳞状细胞癌(81.3%)(P=0.020),ATM mRNA表达随着肿瘤组织分级程度的降低而升高(r=-0.312, P=0.013)。Angele等[7]研究显示前列腺癌中ATM蛋白的表达率(32/49,65.3%)高于其前列腺正常组织(5/49,10.2%),并且ATM蛋白的高表达与前列腺癌的高 Gleason评分有关,8-10的Gleason评分A TM蛋白的表达率为71.9%(23/32),5-7的 Gleason评分A TM蛋白的表达率为52.9%(9/17),但它们的差别无统计学意义,此研究支持我们关于ATM的表达与食管癌组织分化之间的关系,至于ATM表达随着肿瘤分化程度的降低而升高,机制不太清楚,还需我们进一步研究证明。

A TM基因已被证实有明确的辐射保护作用[8]。研究表明,ATM蛋白能够早期感知辐射等所造成的 DNA损伤并启动检测点信号,进行DNA损伤的信号传递,激活的ATM蛋白通过P53依赖和非依赖性途径参与细胞周期检测点信号转导系统的调控,使受到射线辐射损害而导致DNA双链断裂的细胞停滞于各个细胞周期,并对受损的DNA进行修复[8]。Guha等[9]应用ATM的反义RNA抑制A TM蛋白的表达,成功地增加了脑胶质瘤细胞的放射敏感性。其它的方法如通过应用磷酸肌醇激酶抑制剂Wortmannin[10]或基因治疗的方法抑制ATM蛋白表达[11],也可提高细胞对放射线的敏感性,这些实验研究证明ATM基因与细胞放射敏感性的关系。我们实验结果显示, ATM mRNA在食管癌组织中的表达高于食管正常黏膜及食管上皮内瘤变(P≤0.05),食管上皮内瘤变中的表达高于食管正常黏膜,由此我们不难设想如果在食管癌的治疗中特异性地将食管癌细胞ATM基因封闭,造成ATM功能丧失,则会使食管癌细胞对放射线及其类似药敏感性增加,从而增强食管癌的治疗效果,这将是我们后续进一步研究的内容。

[1]Savitsky K,Platzer M,Uziel T,et al.Ataxia-telangiectasia:Structural diversity of untranslated sequences suggests complex posttranscriptional regulation of ATM gene expression.Nucleic Acids Res,1997,25:1678-1684

[2]卜丽佳,张素梅,王雪,等.质粒的制备.安徽医科大学学报,2003,38(1):76-78

[3]Yan jiang,Zheng D liang,Xiaochun Xu,et al.ATM expression is associated with tobacco smoke exposure in esophageal cancer tissues and benzo[a]pyrene diol epoxide in cell lines.Int J Caner,2007,120:91-95

[4]段玉龙,范向辉,史中州,等.食管癌放射治疗同步化疗临床疗效观察.中国肿瘤临床与康复,2009,19(2):138-140

[5]李高峰,王宏梅,陈龙华.原发性肝癌患者ATM表达水平及其临床意义.广东医药,2008,29(10):1652-1653

[6]Albrecht B,Hausmann M,Zitzelsberger H,et al.Array-based comparative genomic hybridization for the detection of DNA sequence copy number changes in Barrett’s adenocarcinoma.J Pathol,2004,203:780-788

[7]Angele S,Falconer A,Foster CS,et al.ATM protein overexpression in prostate tumors:possible role in telomere maintenance.Am J Clin Pathol,2004,121: 231-236

[8]Kish S,Lu KP.A critical role for Pin/TRF1 in ATM-dependent regulation.Inhibition of Pin/TRF1 function complements telomere shortening,radisensitivity,and the G2/M checkpointdefectofataxia-telangiectasia cells.J Biol Chem,2002,277(9):7420-7429

[9]Guha C,Guha U,Tribios S,et al.Antisense ATM gene therapy:a strategy to increase the radiosensitivity of human tumors.Gene Ther,2000,7:852-858

[10]EnnsL,Murray D,Mirzayans R.Effects of the protein kinase inhibitors wortm an in in and KN62 on cellular radiosensitivity and radiation-activated S phase and G1/S checkpoints in normal human fibroblasts.Br J Cancer,1999,81(61):959-965

[11]Collis SJ,Swartz MJ,Nelson WG,et al.Enhanced radiation and chemotherapy-mediated cell killing of human cancer cells by small inhibitory RNA silencing of DNA repair factors.Cancer Res,2003,63(7):1550-1554

图 版 说 明

图A 食管正常黏膜ATM mRNA阴性表达, ISH法 × 100

图B 食管上皮内瘤变ATM mRNA阳性表达, ISH法×100

图C 中分化鳞状细胞癌ATM mRNA阳性表达, ISH法 ×100

图D 低分化鳞状细胞癌ATM mRNA强阳性表达, ISH法 ×100

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.A Negative expression of ATM mRNA in normal esophageal moucose.ISH method×100

Fig.B Positive expression of ATM mRNA in esophageal intraepithelial neoplasia.ISH method×100

Fig.C Positive expression of ATM mRNA in moderately differentiated SCC.ISH method×100

Fig.D Strong positive expression of ATM mRNA in poorly differentiated SCC.ISH method×100

EXPRESSION AND CLINCALSIGNIFICANCE OF ATM mRNA IN ESOPHAGEALCARCINOMA

Jiang Yan,Yin Yu,Cao Liyu＊,Zhang Hongfu,Pan Meihua
(Department ofPathology,A nhui Medical University,Hef ei230032,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of ATM mRNA in esophageal carcinoma.Methods We used in situ hybridization(ISH)to detect the expression of ATM mRNA in 52 cases of normal esophageal mucosal epithelia,45 cases of intraepithelial neoplasia and 63 cases of esophageal squamous cell carcinom(SCC).Results The expression rates of ATM mRNA were 26.9%(14/52),44.4%(20/45)and 63.5%(40/63)in normal esophageal mucosa,intraepithelial neoplasia and esophageal carcinoma,respectively.The expression rate of ATM mRNA in esophageal carcinoma tissues was significantly higher than that in normal esophageal mucosa and intraepithelial neoplasia tissues(P≤0.05).The expressions of ATM mRNA were negatively correlated with the differentiation of SCC(r=-0.312,P=0.013).There was no difference between normal esophageal mucosa and intraepithelial neoplasia tissues in A TM mRNA expression(P=0.07),No significant correlation was observed between ATM mRNA expression and patients’age and sex,the depth of infiltration,lymph node metastasis, tumor stages and other clinicopathological manifestations(P>0.05).Conclusion The abnormal expression of ATM mRNA in esophageal carcinoma can become the new target spot which is hopeful for esophagus cancer treats.

Esophageal neoplasm;Squamous cell carcinoma;A TM;In situ hybridization

R735.1

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.005

2009-10-12

2010-05-26

江燕,女(1975年),汉族,讲师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)