ELISA法早期检测甜菜丛根病毒的初步应用

沙 红，王燕飞，张立明，李承业，董心久，索 博

（新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐830091）

甜菜丛根病 （Rhizomania）是由甜菜多粘菌 （Polymyxa betae）携带的甜菜坏死黄脉病毒 （beet necrotic yellow vein virus,BNYVV）侵染甜菜块根引起的一种土传病毒病害，1959年在意大利北部首先发现。甜菜感染此病后，块根产量将大幅度下降，在中等以上发病条件下一般减产30%～80%，含糖率降低4～9度，工艺质量差，甚至失去加工价值，罹病严重时甚至绝产。新疆是我国甜菜的主产区之一，重茬、迎茬地逐年增加，提高品种抗性已成为品种选育的主要方向之一。

酶联免疫吸附法（ELISA）和RT-PCR是目前室内检测的两种重要的方法，其中利用ELISA能快速准确检测出生长期植株及土壤带毒情况，特别是早期幼苗检测鉴别感病与抗病品种的方法，因其操作简单、速度快、灵敏度高和数据准确而备受关注。通过本次试验研究，希望能为抗病品种的选育提供可靠检测依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）样品：试验材料采自新疆农业科学院玛纳斯试验站甜菜育种基地丛根病人工病圃。2008年5月25日甜菜定苗时随机选取X15号，X14号，902号，913号，923号5个品种新鲜根、叶各10株，共计50株用于ELISA检测；并于2008年10月15日病田田间检测。（2）试剂：酶联免疫试剂盒购于美国AC Diagnostics公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

1.2.2 检测方法 用ELISA检测的样品制备：取甜菜块根0.5g或叶片1g，用样品提取缓冲液研磨备用。具体实验步骤：（1）用包被缓冲液稀释包被抗体（IgG）（500或1000倍，即20mL缓冲液中加入40μL或20mL缓冲液中加入 20μL），在酶标板中每孔加入 200μL；（2）在 37℃下保持 2～4h；（3）用 PBS-Tween 冲洗（可使用洗板机）3次（每次浸泡几分钟），将酶标板倒扣在滤纸上，轻敲吸干；（4）在每两个孔中加入200μL检测样品；（5）4℃下放置过夜；（6）重复步骤（3）；（7）加入稀释后的 IgG-AP；（8）在 37℃下温育 4h；（9）重复步骤（3）；（10）加入200μL用底物缓冲液新配制的底物（1mg/mL，4-硝基苯磷酸盐），室温下30～60min，或延长至理想反应结果；（11）加入50μL 3M NaOH及时终止反应；（12）观察结果：目测或在酶标仪上于405nm下测定吸光值。每个待测样品每次2井（穴），重复3次。

2 结果与分析

2.1 根样检测结果

在此次试验中，阳性对照显黄色，即感病品种应为黄色反应，非感病品种为无色。通过试验结果比对分析，认为在试验所检测的5个品种中，X14号，902号，913号，923号为抗病品种，X15号为感病品种，这与田间收获时剥根鉴定基本一致（见表1）。

表1 甜菜丛根病田间与苗期ELISA检测结果

2.2 叶样检测结果

从试验中可以看出用叶片样品的检验结果与用根样的一致，根样的显色反应更为敏感准确。在试验材料少时，在利用ELISA检测甜菜丛根病时甜菜叶片也可以用做检测的样品。

3 讨论

3.1 ELISA试剂盒较贵，在本试验中也用自配试剂。使用自配试剂的过程中发现其试验结果颜色反应不稳定，因此试验主要采用试剂盒完成。

3.2 在利用叶片为检测材料时，加底物缓冲液新配制的底物显色时间较长，不易把握，时间太久反应易受环境的影响，因此在实际操作中，应准确把握反应时间，及时终止反应以得到准确的结果。

3.3 目前我国利用ELISA检测早期幼苗，鉴别感病与抗病品种的技术还处于实验室小规模试验阶段，与目前丛根病五级目测法相比而言，利用ELISA法检测结果仅为抗、感病，不能对品种抗（感）病的程度（级别）加以区分，对品种抗病性评价不充分。这也是下一步研究工作的一个方面。

[1]李泽，王洪超，吴玉梅，等.利用ELISA和RT-PCR法检测甜菜丛根病病毒（BNYVV）[J].中国甜菜糖业，2008（2）：5-7.

[2]金元，杨莉莉，姚华建，等.利用BNYVV CP蛋白研制甜菜坏死黄脉病毒诊断试剂盒[J].农业生物技术学报，1995（2）：82-85.

[3]冯蕾，董平.应用ELISA及ISEM技术快速检测甜菜植株及土壤中BNYVV[J].西北农业学报，1995（2）:95-96.

[4]蔡惠珍，孙以楚，张春来.应用ELISA检测甜菜品种抗BNYVV病毒差异[J].中国糖料，1997（3）:23-25.

[5]杨继春，秦树才，阎新元，等.甜菜丛根病的发生与防治研究概述[J].中国甜菜糖业，2003（3）:24-31.

[6]高卫士，王燕飞，张立明，等.甜菜丛根病目测鉴评方法及实践[J].中国糖料，2006（1）：41-46.