三种化感物质对水华混合藻类以及多刺裸腹蚤的毒性作用

郑春艳,张 哲,胡 威,许文武,汪好芬,张庭廷(安徽师范大学生命科学学院,生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室,安徽 芜湖 241000)

三种化感物质对水华混合藻类以及多刺裸腹蚤的毒性作用

郑春艳,张 哲,胡 威,许文武,汪好芬,张庭廷*(安徽师范大学生命科学学院,生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室,安徽 芜湖 241000)

为使脂肪酸和酚酸类化感物质能安全有效地用于实际水体水华的预防和控制,以池塘水华混合藻类以及浮游动物多刺裸腹蚤为实验对象,考察了亚油酸、水杨酸和对羟基苯甲酸对两者的毒性作用.结果表明,亚油酸对池塘水华混合藻类具有极高毒,当0.3mg/L时,对水华混合藻类的最大抑制率达到87.6%,水杨酸与对羟基苯甲酸为中毒;化感物质两两联合作用时均具有协同抑藻效应,亚油酸与水杨酸联合协同抑制作用最强;3种化感物质也从不同程度上显示出对多刺裸腹蚤的毒性作用,但亚油酸对多刺裸腹蚤属于高毒,水杨酸以及对羟基水杨酸属于低毒,3者对多刺裸腹蚤的EC50均明显大于对池塘水华混合藻类的EC50,表明了利用这3种化感物质(尤其是亚油酸)来开发生物除藻剂的巨大潜能,同时也说明在可除藻的浓度范围内对环境的不良影响可能较小.

化感物质；水华混合藻类；多刺裸腹蚤；毒性

Abstract：To safely and effectively apply fatty acids and phenolic acids to control and prevent water-bloom, the article studied the toxicity of linoleic acid, salicylic acid and p-hydroxybenzoic acid on natural algal assemblage of pond water and zooplankton Moina macrocopa. The results showed that linoleic acid had the strongest toxicity, while salicylic acid and p-hydroxybenzoic acid had moderate toxicity on the natural algal assemblage of pond water, when the concentration of linoleic acid was 0.3mg/L, the biggest inhibitory ratio was up to 87.6%. The collective activity of a mixture of two allelochemicals were also examined and the synergistic growth inhibition on the natural algal assemblage were proved, in which the mixture of linoleic acid and salicylic acid had stronger toxicity. The three allelochemicals to some extent also showed toxicity on Moina macrocopa, but linoleic acid had stronger toxicity, while salicylic acid and p-hydroxybenzoic acid had lower toxicity on Moina macrocopa, the EC50sof the three allelochemicals on Moina macrocopa was far higher than the EC50son the natural algal assemblage, which indicated that there exists great potential for using the three allelochemicals, especially linoleic acid, to be developed biological algicide agent while no evident toxicity on environment within the concentrations of controling the growth of water-bloom algae.

Key words：allelochemicals；natural algal assemblage；Moina macrocopa；toxicity

蓝藻水华不仅导致生物多样性减少,水体景观价值和服务功能降低,而且蓝藻的次生代谢产物微囊藻毒素(MC)能损害肝脏,促进肝癌发生,

直接威胁人类的健康和生存[1].化感物质的研究为水华的治理提供了较好的思路[2].迄今为止发现的化感物质几乎都是植物次生代谢物.按照化感物质的化学结构可将其分为5大类:脂肪族、芳香族、含氧杂环化合物、类萜和含氮化合物[3-4].而脂肪酸和酚酸是其中两类重要的化感物质[5-6].有研究表明[7-8]亚油酸、亚麻酸等多种多不饱和脂肪酸对海洋藻类有不同程度的抑制作用;本课题组从大型水生植物普生轮藻(Chara vulgaris)中分离得到亚油酸、软脂酸和豆蔻酸三种脂肪酸类化感物质,发现亚油酸具有很强的抑藻作用[9].酚酸类化感物质对藻类抑制作用的报道也很多[10-12],如从高等水生植物穗花狐尾藻中分离出多种对铜绿微囊藻具有很强抑制作用的多酚[12].

迄今为止,关于化感物质抑藻效应的研究大多是以单一化感物质作用于单一藻类,或者是两种化感物质作用于一种藻类等,对天然水体中的混合藻类尤其是水华爆发后的混合藻类的抑制作用报道较少.为探讨脂肪酸和酚酸类化感物质对实际水体混合藻类的抑制作用,本研究在实验室条件下以富营养化的天然池塘水体混合藻类为实验材料,考察了脂肪酸(以亚油酸为代表)和酚酸类化感物质(以水杨酸和对羟基苯甲酸为代表)的抑藻效果;同时,为探讨这3种化感物质能否安全有效地应用于天然水体水华的预防和控制,研究了这3种化感物质对多刺裸腹蚤(Moina macrocopa)的毒性作用.

1 材料与方法

1.1实验材料

多刺裸腹蚤(Moina macrocopa)由本校生命科学院席贻龙教授实验室提供;亚麻酸为东京化成工业株式会社产品(Tokyo chemical industry Co.LTD);亚油酸为Sigma公司(St. Louis, MO, USA)产品;对羟基苯甲酸、水杨酸购于北京化学试剂公司;所有试剂均为分析纯.

1.2抑藻实验

1.2.1样本采集及处理 考虑到蓝藻在水体的垂直分布,于2007年7月18日中午在安徽师范大学校园已爆发水华的富营养化池塘约水下1cm处取样,用100目的塑料纱网过滤以除去群体藻及小型水生动物[13-14],滤液(过滤后的含藻水样,下称藻液)经本院周守标教授鉴定发现其主要优势种为蓝藻门(Cyanophyta)的微囊藻属和绿藻门(Ch lorophyta)的小球藻(Chlorella).在藻液中添加适量BG-11培养基后驯化培养48h再进行抑藻实验.

1.2.2单一化感物质对池塘混合藻类的抑制作用 在已洗净消毒的500mL三角锥形瓶中加入300mL经驯化后的藻液,参照本课题组对单一藻抑制实验的结果[10,15]分别加入不同剂量的脂肪酸类化感物质(亚油酸)或酚酸类化感物质(水杨酸、对羟基苯甲酸)(具体数据见后),振摇,置光照培养箱中进行培养.培养条件:光照度4000Lx,光周期12h:12h,温度(24±2).℃每天摇动锥形瓶4次.实验期间每天取藻液测定藻细胞叶绿素a含量[11,13],连续5d.

1.2.3两种化感物质联合对池塘混合藻类的抑制作用 实验方法同1.2.2,并参照1.2.2实验结果所得出的EC50添加亚油酸与水杨酸以及水杨酸与对羟基苯甲酸联合抑藻.

1.3脂肪酸和酚酸类化感物质对多刺裸腹蚤的毒性作用

1.3.1多刺裸腹蚤培养 多刺裸腹蚤繁殖培养以及毒性实验方法均参照国家标准方法[16-17],具体为采用500mL的烧杯,先在烧杯内装入一定量经24h曝气除氯的自来水,再加进多刺裸腹蚤,密度约每100mL培养液5～10个,每2～3d更换1次培养液,每天喂养1次斜生栅藻浓缩悬浮藻液,斜生栅藻的密度约104～105个左右,藻液的颜色为淡苹果绿色.实验前把怀卵量多的雌蚤用玻璃吸管吸出,用100mL小烧杯分开单个喂养,待产幼蚤达二代后将健康幼蚤挑出作为实验蚤.

1.3.2预实验 正式实验前,为确定实验浓度范围,首先分别对各种化感物质进行预实验,以确定测试化感物质的毒性范围.每组实验中,每只烧杯以10只蚤为一组,亚油酸浓度为0.1,0.4,1.6,6.4, 12.8mg/L;水杨酸浓度为13,69,124,179,234mg/L;对羟基苯甲酸浓度为82,220,359,497,635mg/L.每浓度3个平行,同时设对照组.观察24h后,求出100%抑制浓度(绝对抑制浓度EC100)和无抑制浓度(最大耐受浓度EC0),然后根据预备实验得出的浓度范围来确定正式实验所用的浓度[18-19].

1.3.3单一化感物质对多刺裸腹蚤的毒性实验 根据预实验在EC100～EC0浓度范围内选取6个不同浓度,亚油酸浓度为0.2,0.4,0.8,1.6,3.2, 6.4mg/L;水杨酸浓度为55,83,110,138,166, 193mg/L;对羟基苯甲酸浓度为110,193,276,359, 442,525mg/L;设不加化感物质的空白对照组,每组3个平行.从培养容器挑选个体健壮,大小差不多的第2代幼蚤进行实验.在100mL的烧杯中随机放10只多刺裸腹蚤,置光照培养箱进行培养.培养条件同预试验,实验期间不喂食,于24,48, 72h定时观察多刺裸腹蚤活动受限制(游动抑制)的蚤数.

1.4数据处理

整个抑藻实验所得数据均经SPSS13.0软件处理, 通过单因素方差分析检验有关化感物质对池塘水华混合藻类的影响、通过概率法求出各化感物质的EC50;藻生长抑制率(IR)根据公式:IR(%)=(1–N/N0)×100进行计算,其中,N为实验组叶绿素a含量(mg/L), N0为同期对照.毒性试验通过查表[20]将多刺裸腹蚤的抑制率换算成概率,用浓度-概率法通过Excel建立回归方程,求出EC50,再按文献[20]计算EC50的95%置信限.

2 结果与分析

2.1单一化感物质对池塘水华的影响

由图1可见,3种化感物质均具有很强的抑制池塘水华混合藻类的作用,以亚油酸的抑制作用最强,实验第1,2,3,4d,EC50分别为0.57,0.26, 0.09,0.07mg/L,而第5d只有0.06mg/L,最大抑制率出现在0.3mg/L亚油酸组,与同期对照相比,最大抑制率为87.6%,P＜0.05;两酚酸组对池塘水华藻类的抑制作用总体较亚油酸弱,同时显示出了其多面性:低浓度水杨酸(40mg/L)组对池塘水华藻类有轻度的促进作用,虽然统计学处理显示无明显差异,但促进趋势明显;实验第1,2,3,4,5d,水杨酸及对羟基苯甲酸抑藻作用的EC50分别为109.57,86.24,71.38,52.31,42.76mg/L,131.85,115.23, 76.16,78.57,82.62mg/L.水杨酸及对羟基苯甲酸最大的生长抑制率分别在第5d,第3d,达到了81.2%,和61.9%.统计学显示,两酚酸对池塘水华藻类的生长抑制均具有显著性(P＜0.05).根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ/T 154—2004)中的分级标准[21],亚油酸属于极高毒(24h或48h EC50(mg/L)＜1),水杨酸以及对羟基水杨酸属于中毒(24h或48h EC50(mg/L)＞10～100).因此,该结果进一步提示利用这3种化感物质尤其是对水华混合藻类极高毒的亚油酸来进行生物杀藻剂的研究开发是具有巨大潜能的.

图1 三种不同化感物质单独对池塘水华混合藻类的抑制作用Fig.1 Effects of three different allelochemicals on water bloom algae of pond water, respectively

2.2化感物质联合对池塘水华的影响

根据上述实验结果,联合实验设计为:① 0.2mg/L亚油酸+70.0mg/L水杨酸;②0.2mg/L亚油酸+70.0mg/L对羟基苯甲酸;③70.0mg/L水杨酸+70.0mg/L对羟基苯甲酸,根据文献[12]方法计算在实验的第5d组合①的抑制率应为71.4%～ 86.6%,组合②的抑制率应为68.9%～77.2%,组合3的抑制率为53.8%～65.9%,但由图2可知,组合①和组合②在第4d已将池塘混合藻类全部杀死,抑制率达100%,组合③抑藻率也达到了89.5%,具有显著性差异(P＜0.05),表明3种组合均具有十分明显的协同抑藻作用.但相比之下,亚油酸参与的组合抑藻效果更佳,这可能与化感物质组合后的作用机制不同有关,因此后期研究中需要对此进行深入探讨.

2.33种化感物质对多刺裸腹蚤的毒性作用

图2 化感物质联合对池塘水华混合藻类的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects on natural algal assemblage ofpond water by mixture of allelochemicals

3种化感物质对多刺裸腹蚤的毒性作用见表1.由表1中实验数据求出各时间内浓度与概率单位的回归方程以及EC50的95%置信限(表2).

由表2可知,3种化感物质对多刺裸腹蚤也具有不同程度的毒性作用,根据国家环境保护总局《新化学物质危害评估导则》(HJ / T 154—2004) 中的分级标准[21],亚油酸对于多刺裸腹蚤属于高毒(24h或48h EC50＞1～10mg/L),水杨酸以及对羟基水杨酸属于低毒(24h或48h EC50＞100 mg/L). 但比较亚油酸对于多刺裸腹蚤以及池塘水华混合藻类的作用则不难看出,亚油酸对多刺裸腹蚤的EC50无论在24h、48h还是72h都远远比亚油酸对池塘水华混合藻类的EC50大得多,是抑藻时的4～9倍之多,这无疑提示了在利用亚油酸来预防或治理水华的浓度范围内,对环境中多刺裸腹蚤的安全性威胁不会很大.同样,水杨酸和对羟基苯甲酸对多刺裸腹蚤的EC50也较其抑制池塘水华混合藻类的EC50高,特别是对羟基苯甲酸,这些也同样提示了若利用这两种酚酸类物质来预防和治理水华藻类对环境的安全性影响可能较小.

表1 3种化感物质对多刺裸腹蚤毒性实验结果Table 1 The toxicity experiment results of the three allelochemicals to Moina macrocopa

表2 3种化感物质对多刺裸腹蚤的EC50(mg/L)及95%置信限Table 2 EC50(mg/L) and 95% confidence limits of the three allelochemicals to Moina macrocopa

3 讨论

化感作用定义为“一种植物通过向环境中释放化学物质影响其他生物生长的现象”.释放的化学物质称为化感物质[3].利用化感物质抑制水华藻类的生长是目前环境领域研究的一大热点.本研究中的亚油酸、水杨酸以及对羟基苯甲酸均发现可由某些水生和陆生植物分泌,并对其他植物产生化感作用[6,8-12].虽然植物向环境中释放的化感物质不一定能够达到有效的浓度,但通过对化感物质的研究可为开发生物除藻剂等提供有价值的参考依据.

对酚酸和脂肪酸的抑藻作用的有关研究大多是采用单一化感物质抑制单一藻类, 对复合藻类的抑制作用研究相对较少.另外,不同的化感物质对藻类的毒性大小不一,对环境中的其他生物的毒性也不一样,对水华藻类抑制作用大的可能对环境中的其他生物毒性较小;反过来,对水华藻类抑制作用小的也可能对环境中的其他生物毒性作用较大.如张庭廷等[22]研究了17种脂肪酸类物质的抑藻作用,揭示了脂肪酸的抑藻活性与其结构有关,即不饱和脂肪酸的抑藻效果较饱和脂肪酸好,不饱和程度越高抑制作用越佳,饱和脂肪酸中碳链越短抑藻效果越好.而 Liu 等[23]采用了亚油酸等9种偶数碳脂肪酸去抗4种植物病原体,发现饱和脂肪酸的抗生效果较好,碳链越长抗生作用越强,而两种不饱和脂肪酸抑制作用最差,这与脂肪酸类物质抑藻效应所得结果刚好相反.因此,若采用化感物质开发生物除藻剂时,必须考察化感物质对环境的其他生物的可能毒性,这样才不至于造成新的生态平衡失调.

4 结论

4.1亚油酸、水杨酸以及对羟基苯甲酸对池塘水华混合藻类均具有显著的抑制作用,其中亚油酸的作用最强,按照对藻类生长抑制毒性分级标准,亚油酸属于极高毒,水杨酸与对羟基苯甲酸属于中毒;3种化感物质两两联合作用时具有协同抑藻效应,亚油酸与水杨酸联合协同抑制作用最强.

4.23种化感物质也显示出对多刺裸腹蚤的毒性作用,但按照蚤类急性活动抑制毒性分级标准,亚油酸对多刺裸腹蚤属于高毒,水杨酸以及对羟基水杨酸属于低毒.

4.33种化感物质对池塘水华混合藻类的EC50明显小于对多刺裸腹蚤的EC50,表明了利用这3种化感物质(尤其是亚油酸)来开发生物杀藻剂的巨大潜能,同时也说明在可杀藻的浓度范围内对环境的不良影响可能较小.

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The toxic effect of three allelochemicals on natural algal assemblage and Moina macrocopa.

ZHENG Chun-yan, ZHANG Zhe, HU Wei, XU Wen-wu, WANG Hao-fen, ZHANG Ting-ting*(The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China). China Environmental Science, 2010,30(5)：710～715

X171.5

A

1000-6923(2010)05-0710-06

郑春艳(1982-),女,安徽淮北人,安徽师范大学生命科学学院硕士研究生,主要研究方向为淡水藻类生态学.发表论文3篇.

2009-09-30

国家自然科学基金资助项目(30870429);安徽师范大学博士科研启动基金

* 责任作者, 教授, cyhztt@mail.ahnu.edu.cn