两种异位心脏移植小鼠模型的建立和比较

陈义发,尹辉,梁宾勇,黄致远,刘洪亮,陈孝平,龚非力

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院外科学系,武汉 430030; 2.华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉 430030)

研究报告

两种异位心脏移植小鼠模型的建立和比较

陈义发1,尹辉2,梁宾勇1,黄致远1,刘洪亮1,陈孝平1,龚非力2

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院外科学系,武汉 430030; 2.华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉 430030)

目的 比较腹部和颈部小鼠心脏移植模型的优缺点,探讨二次器官移植或双心脏移植研究的可行性和实用性动物模型。方法参照Ono法和Chen法并加以改进,建立了同系或者同种小鼠腹部和颈部异位心脏移植模型,同时对两种手术方式的成功率、手术时间、移植心脏存活时间和病理组织学进行了比较。结果腹部和颈部异位心脏移植手术成功率分别为86.7%和83.3%,两种手术方式在总手术时间、移植心脏存活时间和病理组织形态学检查上均无明显差异(P>0.05)。结论在熟练掌握显微外科技术的基础上,两种异位心脏移植模型都能顺利建立,两者既可分开选用,又可结合运用,以适应不同实验需求。

心脏移植;动物模型;小鼠

心脏移植动物模型是进行移植免疫学研究的重要工具,由于近交系小鼠的品种较多,以及多种检测试剂和单克隆抗体来源于小鼠,还可减少药物用量,节省开支,因而小鼠在心脏移植免疫研究中占有了不可替代的地位。目前,小鼠异位心脏移植模型的建立方法通常有两种:腹腔异位心脏移植术[1,2]和颈部异位心脏移植术[3],两种方法各有特点,可根据实验条件选用。两种异位移植模型若能结合运用,将为今后的二次器官移植和移植排斥反应的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物:雄性近交系BALB/c小鼠与C57BL/6小鼠选自华中科技大学同济医院器官移植研究所实验动物中心【SCXK(沪)2007-0005】,体质量22～25g。所有动物均饲养于清洁环境。

1.1.2 手术器械:显微外科手术器械为上海手术器械厂产品;YZ20 PS手术显微镜购自苏州医疗仪器总厂;无创性血管夹,上海手术器械厂生产;3/0、5/0和11/0无损伤缝合线,上海医用缝合针厂生产。

1.1.3 麻醉药物:0.5%戊巴比妥钠按15 mL/(kg ·bw)腹腔注射。

1.2 实验分组

动物实验分为四组:I组采用腹腔异位心脏移植术,以C57BL/6小鼠为供者和受者的同系移植;II组采用腹腔异位心脏移植术,以BALB/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者的同种异体移植;III组采用颈部异位心脏移植术,以C57BL/6小鼠为供者和受者的同系移植; IV组采用颈部异位心脏移植术,以BALB/c小鼠为供者、C57BL/6小鼠为受者的同种异体移植。每组均进行15次移植手术,移植总数为60次,其中供、受者小鼠各60只。

1.3 供心切取手术

小鼠麻醉后仰卧位固定,行腹正中线切口,暴露下腔静脉并缓慢注入100 U/mL肝素生理盐水0.5 mL,1～2 m in后横断腹主动脉和下腔静脉放血。迅速打开胸腔,0～4℃生理盐水停搏心脏,去除周围脂肪组织及胸腺,分别在靠近右心房处分离结扎下腔静脉和右上腔静脉,远端剪断。游离升主动脉、无名动脉和肺动脉:如果采用腹部异位心脏移植术,则游离升主动脉并在无名动脉分支处近心端剪断,游离肺动脉主干并在分支处剪断;如果采用颈部异位心脏移植术,则在无名动脉分支处远心端结扎主动脉,远端剪断,然后在无名动脉分支处远心端剪断,游离肺动脉主干并在分支处剪断。然后用5/0缝合线结扎左上腔静脉、左肺静脉和右肺静脉以及周围组织,并在远心端剪断,全心修剪后放入0～4℃生理盐水保存。

1.4 受者手术

吻合血管时,以冰盐水棉片保护供心,棉片周围覆以冰屑以防移植心脏复温造成热缺血损伤。

1.4.1 小鼠腹部异位心脏移植术:①移植部位的准备:沿腹正中线剪开小鼠腹腔,将胃、小肠、结肠等腹腔器官用温生理盐水纱布包裹,提向切口右上方。打开后腹膜,充分显露腹主动脉和下腔静脉腹腔段全长,剥离两根血管前方及周围的软组织,小心分离相邻的两根血管,上至肾动、静脉分支处,下至髂内、外血管分支处。下腔静脉在此段有2～3处腰静脉的汇入支,分别结扎后切断,用5/0缝合线在游离开的两根血管近心端和远心端各结扎一道,不必过紧,以正好阻断血流为度。②供心植入:在两根结扎线中间处,微微提起腹主动脉前壁,剪一个与供心主动脉口径相适的“0”形孔,用肝素等渗盐水冲净血管内血液。供心主动脉与受者腹主动脉进行端侧吻合,其方法:从两动脉外侧壁开始,采用连续外翻缝合法,镜下边距1 mm,针距1 mm,一般约需缝4～5针。缝合后,将供心翻向对侧,接外侧壁的缝合线,继续用连续外翻法缝合动脉内侧壁。随后在下腔静脉前壁,剪一个与供心肺动脉口径相适的“0”形孔,用肝素生理盐水冲净血管内血液。同样,肺动脉和下腔静脉进行端侧吻合,采用连续外翻缝合法。镜下针距和边距均为2 mm。需要注意的是,静脉内侧壁吻合是在血管内进行,此处要形成吻合口管壁外翻,则需要使用血管外吻合时的连续内翻缝合技术。缝线两端打结时,尤其是静脉需计算并预留出血管充盈后的距离。动、静脉血管吻合即将结束前,用肝素生理盐水充盈血管,将血管内空气排除干净。吻合完毕后先开放远心端血管,随后间断开放近心端血管,小的出血点可以压迫止血,也可以缝合出血点。恢复血供后,供心于1～2 m in内由纤颤转变为复跳,检查无出血,摆正供心位置,用3/0缝合线连续缝合关闭皮肤切口。

1.4.2 小鼠颈部异位心脏移植术:①移植部位的准备:从右下颌中点至右锁骨中点处剪一长约1cm斜切口,分离皮下组织,游离右侧颈外静脉,在远心端分支处用5/0缝合线结扎,微血管夹近心端阻断静脉,并在远心端横断;切断右侧胸锁乳突肌,游离右颈总动脉至颈内、外动脉分叉处,结扎颈总动脉,微血管夹阻断近心端,横断颈总动脉。②供心植入术:供心主动脉与受者颈总动脉进行端端吻合,采用间断外翻缝合法。以冰盐水纱布包裹供心置于受者右颈部,注意调整好供心位置以利吻合。其方法:先在3点(时钟定位法,下同)处吻合一针,然后在对侧9点处吻合第二针,前壁11点及1点处各吻合一针,翻转微血管夹暴露后壁,在后壁7点及5点处各吻合一针,然后恢复至原来的位置(共计6针)。注意尽可能保持边距及针距均匀对称。供心肺动脉与受者颈外静脉同样进行端端吻合,采用连续缝合法。具体为先在3点处吻合一针打结,在原位由外向内向肺动脉内进一针,然后由右向左腔内连续缝合至对侧9点处,再由左向右腔外连续缝合至3点起始处,不必打结,留线头约0.5cm,共缝约8～10针。吻合完毕后先开放静脉,若吻合口有渗血,可用小棉球轻压片刻即可,一般不需补针。随后开放动脉,若吻合口有出血,可间断开闭微血管夹,减轻吻合口压力,一般在3～5 m in内间断开放2～3次可以止血,如仍出血可考虑补针。开放后1～2 m in内供心即可由纤颤转变为复跳。调整移植心脏于合适位置以防血管扭曲,待移植心脏复跳稳定,用3/0缝合线连续缝合皮肤切口。

1.5 术后处理和观察

所有受者术后给予5%葡萄糖等渗盐水0.4 mL,皮下注射。术后小鼠多于1 h内苏醒,每日作腹部或颈部触诊,了解移植心脏搏动情况。移植心脏搏动72 h以上计为手术成功。

1.6 病理检查

术后7 d分别切取同系移植和同种移植组心脏各6只,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜检查心肌结构。

1.7 统计学处理

数据以均数±标准差表示,采用t检验, P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 手术成功率

腹腔异位心脏移植I组和II组的手术总成功率达86.7%(26/30),4次手术失败的原因均为动脉吻合口出血。颈部心脏移植III组和 IV组的手术总成功率达83.3%(25/30),5次手术失败,原因为动脉吻合口狭窄、血栓形成3次,吻合口出血2次。结果显示,两种手术方式的成功率差异无显著性(P>0.05)。

2.2 手术时间

两种小鼠异位心脏移植术中供者手术方法有所不同,差异在于主动脉与肺动脉之间游离的长度,行颈部异位心脏移植术时要充分分离出无名动脉,因此时间长于腹腔异位心脏移植术。在受体手术方法上存在差异,腹腔异位心脏移植术在受体准备时间和供心植入时间略长于颈部异位心脏移植术。但在整个手术时间上(见表1),从供者剪开腹正中线到受者缝好皮肤,腹腔异位心脏移植术(79.1±4.9 m in),颈部异位心脏移植术(74.9±4.4 m in)的差异无显著性(P>0.05)。

2.3 移植心脏存活时间

同系与同种异位心脏移植术相比,同系移植组的移植心脏平均存活时间超过100 d,而同种移植组的移植心脏平均存活时间分别是腹腔异位心脏移植术为7.4±1.0 d和颈部异位心脏移植术为7.5± 0.9 d,两者相比差异无显著性(P>0.05)。

2.4 病理检查

在移植后第7天病理学检查,两种移植术在同种移植组均显示移植心肌呈弥漫性多种类型细胞浸润,伴有明显的水肿、出血和心肌细胞坏死;而在同系移植组均显示心肌结构无损伤表现。

表1 小鼠腹腔异位心脏移植和颈部异位心脏移植的手术时间比较(±s,m in)Tab.1 Comparison of the operation tim e of celiac and cervical heterotop ic heart transp lantations in the m ice(±s,m in)

表1 小鼠腹腔异位心脏移植和颈部异位心脏移植的手术时间比较(±s,m in)Tab.1 Comparison of the operation tim e of celiac and cervical heterotop ic heart transp lantations in the m ice(±s,m in)

手术进展时间Time of operation p rocedure移植部位Transp lantation site 供心准备Preparation of donor受者准备Preparation of recip ient动脉吻合Anastomosis of artery静脉吻合Anastomosis of vein总时间Total time腹腔Abdom inal cavity 10.5±1.6 12.4±2.3 18.9±2.3 23.5±2.7 79.1±4.9颈部Cervical part 12.8±1.7 11.7±1.8 17.0±2.2 17.9±2.2 74.9±4.4

3 讨论

啮齿类动物带血管的异位心脏移植模型是进行移植排斥和免疫耐受研究较为理想的工具,其中大鼠异位心脏移植由于动物体型较大,较容易复制成功,而小鼠体型较小,对显微外科的设备和技术要求比较高,模型建立难度较大。但小鼠具有其他动物品系无法替代的优点:丰富的遗传背景资料,且H-2系统与人类HLA系统具有高度的相似性;近交系品种繁多可供选择空间大,诊断试剂齐全;实验成本低,适合于价值昂贵的新型免疫抑制剂和药物研究,结果可重复性好。随着二次移植手术在临床器官移植中的需求日益突出,其免疫相关机制势必更加复杂,因此,研究如何建立和应用不同小鼠异位心脏移植模型显得尤为重要。

目前小鼠异位心脏移植模型所采用的手术方式分为两种,区别在于供心植入的部位不同。腹腔异位心脏移植术是将供心移植于受者腹腔,供心主动脉与受者腹主动脉、供心肺动脉与受者下腔静脉做端侧吻合;颈部异位心脏移植术则是将供心移植于受者颈部,供心主动脉与受者颈总动脉、供心肺动脉与受者颈外静脉进行端端吻合。根据文献报道和我们的实验证实,两种手术方式与同种异体移植排斥反应的强度无相关性,同种供心移植的存活时间为6～9 d,而同系移植存活时间均大于100 d以上,结果提示可重复性好,两种模型的手术方式均稳定可行。只要能熟练掌握显微血管吻合技术,两种手术方式的成功率和手术时间均无明显差异,可根据实验设计安排合理运用。结合在异位心脏移植模型建立过程中的改进和体会,总结两种手术方法各自的特点,供选择时参考。

1969年,Ono[4]克服了Abbott氏腹腔异位心脏模型的主要缺点,将端端吻合改为端侧吻合术后,显著提高了术后模型存活率,从而得以广泛应用。其主要特点为腹腔空间大,操作简便,术后发生血管扭转所造成的移植物非免疫排斥几率小。小鼠腹主动脉与颈总动脉相比,管径粗,仅需在25倍手术显微镜下就能完成手术,吻合成功率高。开腹手术会增加感染机会,也会加重受者损伤,但可通过加强围手术期护理和使用抗生素来降低其发生率。在对受体小鼠腹主动脉和下腔静脉的阻断和吻合过程中,我们对Ono法进行了改进。由于腹主动脉和下腔静脉粘连非常紧密,过度分离易造成出血,并且细小分支的存在,导致可供吻合的区域非常狭小,故我们在打开后腹膜时,只将腹主动脉和下腔静脉与周围组织游离,既可防止血管分离时出血又可减少血管游离时间;动静脉近心端和远心端分别用5/0缝合线同时结扎阻断,可为供吻合的血管提供足够的长度。吻合前先用5号针穿刺腹主动脉壁,再沿穿刺孔剪开,进行主动脉-腹主动脉吻合,随后在下腔静脉壁上开口,进行肺动脉-下腔静脉吻合,这样有效克服静脉在吻合时的显露不充分的困难。小鼠颈部心脏移植模型由Chen[3]1991年创建,其主要特点有:小鼠颈部血管解剖清楚,颈外静脉和颈总动脉分开走行,分离血管相对容易;动脉和静脉吻合采用的是端端吻合方式,手术较灵活方便;颈部手术切口小,造成的损伤小,术后恢复快,感染率低。但也有明显的不足,由于颈总动脉直径小,至少需要30倍手术显微镜才能完成吻合,显微技术难度较大。

小鼠异位心脏移植已成为移植免疫和药理等研究的重要模型,特别是在近些年来对二次移植免疫和慢性排斥反应研究日趋深入的过程中,显示出无与比拟的优越性。腹腔异位心脏移植和颈部异位心脏移植的手术方式均与移植排斥反应强度无相关性,显示了两种模型稳定性好,变异率小的优点。只要经过显微手术训练,掌握血管吻合技巧,两种模型的手术成功率都将超过80%,两者差异无显著性,因此,可根据不同实验室的具体条件,灵活选用其中的手术方式之一,而在建立二次移植模型时则可同时选用两种手术方式,将为解决临床器官二次移植所面临的困难提供新的实验依据。

[1] Corry RJ,W inn HJ,Russel PS.Prim arily vascu larized allografts of hearts in m ice[J].Transp lantation,1973,16:343-350.

[2] Chen YF,Dem ir Y,Valu jsk ikh A,et al.Antigen location contributes to the patho logical featu res of a transp lan ted heart graft[J].Am J Patho l,2004,164:1407–1415.

[3] Chen ZH.A new technique of cervical heterotop ic heart transp lantation in m ice[J].Transp lantation,1991,52:1099-1101.

[4] Ono K,L indsey ES. Imp roved technique of heart transp lantation in rats[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1969,57:225-229.

Estab lishm en t and Com par ison of TwoM ouse M odels of Celiac and Cerv ica l Heterotop ic Hear t Tran sp lan ta tion

CHEN Yi-fa1,Y IN Hui2,L IANGB in-yong1,HUANG Zhi-yuan1, L IU Hong-liang1,CHEN X iao-p ing1,GONG Fei-li2
(1.Departm ent of Surgery,Tongji Hosp ital,2.Departm ent of Imm uno logy,HuazhongUniversity of Science and Techno logy,W uhan,430030,China)
Corresponding authors:CHEN X iao-p ing,E-m ail:chenxp@m edm ail.com.cn and GONG Fei-li,Em ail:flgong@163.com

Heart transp lantation,celiac;Heart transp lantation,cervical;Anim almodel;M ouse

R654.28

A

1005-4847(2010)01-0017-04【Abstract】 O b jective O b jective In order to better keep up w ith the developm ent of transp lantation imm unobiology, we estab lished and compared two types of mouse heterotop ic heart transp lantation,and hope to help further organ transp lantation studies.M ethods A ccording to the surgicalp roceduresofOno’s type and Chen’s type ofmousemodelof heterotop ic heart transp lantation w ith som e modification,we perfo r m ed celiac and cervical heteropotic heart transp lantation betw een iso-strains and hetero-strains,and compared the operation success rate,operation tim e,allograft survival t im e, and histopatho logy of those estab lishm ent m ethods.ResultsThe success rates of mouse celiac and cervical hetero top ic heart transp lantation were 86.7%and 83.3%,respectively,w ith a non-significant difference(P>0.05)between the two m ethods of operation regarding the total operation tim e,survival tim e of the allografts,and histopatho logical findings. Conc lusion s Based on the m astery ofm icrosurgical techniques,the two models of heterotop ic mouse heart transp lantation can be estab lished equally,and either of them can be considered depending on the particular requirem ents of studies.

2009-04-16

国家自然科学基金资助项目(30571754,30671900);留学回国人员科研启动基金教外司留[2005]383号;国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.2001cb500008);教育部博士点基金项目(No.20040487056)。

陈义发(1963-),男,副教授,博士。研究方向:移植免疫。E-mail:yfchen@tjh.tjmu.edu.cn

陈孝平,E-mail:chenxp@medm ail.com.cn;龚非力,E-mail:flgong@163.com