DNCB致敏/激发Nc/Nga小鼠特应性皮炎模型的建立

郭亚南，文海泉

(中南大学湘雅二医院皮肤科，长沙 410011)

DNCB致敏/激发Nc/Nga小鼠特应性皮炎模型的建立

郭亚南，文海泉

(中南大学湘雅二医院皮肤科，长沙 410011)

目的 研究外用2，4-二硝基氯苯(DNCB)对Nc/Nga小鼠的致敏作用，探索建立特应性皮炎(AD)模型的方法。方法 外用1%DNCB7周，间隔为1周，重复刺激并致敏7周大NC/Nga小鼠的双侧耳朵及背部皮肤。结果 外用DNCB7周可以引起显著的炎症，并伴有高滴度的IgE和IL-4，利用HE染色进行组织病理分析，提示表皮炎性细胞明显增加。结论 外用DNCB重复刺激Nc/Nga小鼠能产生AD样皮炎，可以作为研究AD病因及治疗AD的有效动物模型。

特应性皮炎;模型，动物;Nc/Nga小鼠

特应性皮炎(AD)是常见的皮肤病之一，伴有剧烈瘙痒且易复发，对患者生活质量影响大。建立合适的动物模型是研究 AD的基础，国外资料显示Nc/Nga小鼠可以产生AD样皮损，血浆内IgE、IL-4增高，与人类AD相似。我们采用外用DNCB刺激Nc/Nga小鼠，建立了AD动物模型，以期有助于AD治疗新药的研发。

1 材料和方法

1.1 动物与试剂

从Charles River Laboratories Japan购得 6周大SPF级Nc/Nga小鼠。实验开始前放置在空调房间中1周适应环境，房间温度保持在23℃±3℃，湿度保持在50% ±0%，照明时间为早8点到晚8点，自由取食。小鼠 IL-4、IgE酶联免疫检测试剂盒购自Invitrogen公司，DNCB购自北京市化学试剂公司，DNCB溶解于丙酮/橄榄油(1∶3)当中，浓度为1%。

1.2 方法

皮损诱导参考DNCB诱发Nc/Nga小鼠皮炎的文献并稍有改进［1］，10只 Nc/Nga小鼠随机分成2组(n=5)，模型组:小鼠7周龄时用1%的DNCB 20 μL涂抹在小鼠足垫及除毛之后的腹部，1周后用DNCB涂抹在小鼠双侧耳部及背部，每周1次，共6次。对照组:用丙酮/橄榄油(1∶3)代替DNCB。

1.3 观察指标

1.3.1 皮损严重程度:观察各组小鼠皮炎情况并拍照，第14周末，用游标卡尺测量小鼠耳部厚度。

1.3.2 小鼠搔抓行为:第14周末，将小鼠单独放置，观察10 min内小鼠搔抓耳部、背部的次数，连续搔抓算作一次。

1.3.3 血清IgE、IL-4的含量:第14周末摘除小鼠眼球，眼眶内取血，肝素钠抗凝血在4℃下3000 r/ min离心30 min，获取血浆，并保存在 －20℃中，利用酶联免疫吸附试验检测血浆中细胞因子的浓度。

1.3.4 组织病理:处死小鼠后，耳部皮损组织用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色后显微镜下观察组织病理改变。

1.4 统计学处理

计量资料以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果(图1～2见彩插2)

2.1 皮损炎性反应

我们的试验表明外用 DNCB第1次刺激 Nc/ Nga小鼠，皮肤无改变，第2次刺激24 h后，可见耳朵出现肿胀，颈背部出现脱毛及抓痕，随着刺激的增加，小鼠脱毛范围扩大，并有明显的糜烂渗血等改变，第7次刺激后，在小鼠颈背部皮肤出现红斑、渗出、出血和表皮剥脱、脱毛，双侧耳朵出现明显肿胀、出血、结痂;对照组小鼠皮肤无明显改变(图1)。

图1 模型组和对照组小鼠皮损炎性反应比较Fig.1 The Ocomparison of skin inflammation between model group(A) and control group(B)

图2 耳朵HE染色切片（×40）Fig.2 HE stain of ear slice（×40）

2.2 组织病理分析

模型组表皮增厚、过度角化、细胞间水肿、表皮和真皮内有大量淋巴细胞浸润;对照组组织病理无明显改变(图2)。

2.3 血清IgE和IL-4的浓度

与对照组血浆 IgE浓度(10.96±4.03 ng/mL)相比，外用 DNCB7周后，模型组血浆 IgE浓度(165.65±12.16 ng/mL)显著增加(P<0.05)。与对照组血浆与对照组血浆 IL-4浓度(62.03± 11.15 pg/mL)相比，模型组血浆IL-4浓度(87.75± 2.25 pg/mL)显著增高(P<0.05)。

2.4 小鼠耳朵厚度和搔抓行为

在用DNCB之后，平均小鼠耳朵厚度为0.75± 0.033 mm，与对照组(0.24±0.014 mm)相比，差异显著(P<0.05)。和对照组小鼠搔抓行为频次(2.4 ±1.14)相比，重复外用DNCB7周后，小鼠搔抓行为频次(18.6±1.82)显著增加(P<0.05)。

3 讨论

特应性皮炎，原称“异位性皮炎”、“遗传过敏性皮炎”，是一种与遗传过敏素质有关的特发性皮肤炎症性疾病。本病表现为剧烈瘙痒、多形性皮损并有渗出倾向，常有易患哮喘、过敏性鼻炎、湿疹的家族性倾向，对异种蛋白过敏，血清中 IgE水平升高，外周血嗜酸性粒细胞增多。患者Th2细胞在皮损中显著增高，其产生的 IL-4和 IL-5增多，可导致 IgE增高和嗜酸性粒细胞的增多。病因尚不完全清楚，根据流行病学调查，儿童发病与其父母过敏素质明显相关。母亲一方有特应性皮炎者，其子女出生后3个月内发病率可达25%以上，2岁内发病率可达50%以上;如果父母双方均有特应性疾病史，其子女特应性皮炎发病率可高达79%。外界环境中的变应原(如屋尘螨、花粉等)可诱发AD，某些患者用变应原进行皮试可出现皮肤湿疹样改变。总之，特应性皮炎的病因与发病机制目前还不很清楚，迫切需要建立一个合适的动物模型，以明确慢性瘙痒的机制并研发控制慢性炎性疾病中瘙痒的药物。以往在AD研究中应用的动物模型，均为对正常动物反复致敏而成，它与以特应性遗传素质为发病基础的AD有着本质区别。

1997年，日本东京农工大学农学部 Matsuda等［2］在世界上首次发表了与人类AD十分相似的动物模型 NC/Nga鼠的研究报告。Matsuda报道 NC/ Nga小鼠在普通环境下饲养可以出现严重的瘙痒，皮肤干燥并有皮肤屏障功能障碍，皮损病理表现为棘层水肿，表皮肥大细胞增多、炎性细胞浸润，血浆IgE和Th2细胞因子如IL-4水平升高。尘螨是诱发AD最重要的自然变应原，而粉尘螨是其中最普遍的一种。应用粉尘螨刺激NC/Nga鼠和BALB/c鼠背部皮肤，每周3次，连续8周后NC/Nga鼠出现类似AD的皮损和免疫生化改变，而BALB/c鼠仅特异性IgE升高，未出现类似皮损［3］。可见，NC/Nga鼠对外界抗原的免疫反应与AD患者类似。

近来的多个研究发现，在普通环境下饲养时，并非所有NcNga小鼠都能自发产生 AD样皮损［4－6］，需应用半抗原或者螨虫抗原激发稳定的湿疹。我们采用1%DNCB重复刺激Nc/Nga小鼠的方法，以诱发小鼠皮炎。通过观察小鼠皮肤，测量耳朵厚度及其搔抓行为，评价炎性程度，并检验血浆内IL-4、IgE的含量来判断模型是否制作成功。试验显示我们从日本Charles River Laboratories Japan引进的Nc/Nga小鼠，在普通环境中生长7周，均未发现小鼠的明显搔抓行为，皮肤没有红斑、丘疹、结痂、鳞屑等改变，说明此鼠在普通环境下生长并没有明显的皮炎产生，与上述发现相似。我们第一次应用DNCB刺激小鼠足垫及除毛的腹部后1周内，局部皮肤未出现任何炎性反应，说明 DNCB对皮肤没有直接损伤。重复外用DNCB7周，可以引起Nc/Nga小鼠明显的湿疹样改变，耳部、颈、项、背部出现脱毛、红斑、渗出、表皮剥脱、结痂，双侧耳朵出现肿胀、出血、结痂等表现;组织 HE染色显示小鼠表皮增厚、过度角化、细胞间水肿，表皮和真皮内有大量淋巴细胞浸润。上调血浆中IgE和IL-4的浓度，同时伴有搔抓行为的增加。这种慢性瘙痒性皮损并伴随 IgE和 IL-4的增高，提示此模型为Th2型细胞反应占优的炎症，与人类特应性皮炎有相似之处。

总之，我们通过外用DNCB刺激Nc/Nga小鼠，成功的建立了 AD样慢性瘙痒性模型，这个模型对于研发治疗AD的新药是一个有效的工具。

［1］Pokharel YR，Lim SC，Kim SC，et al.Sopungyangjae-Tang inhibits development of dermatitis in Nc/Nga mice［J］.eCAM，2008，5 (2):173－180.

［2］Matsuda H，Watanabe N，Geba GP，et al.Development of atopic dermatitis-like skin lesion with IgE hyperproduction in Nc/Nga mice［J］.Int Immunol，1997，9:461－466.

［3］Matsuoka H，Maki N，Yoshida S，et al.A mouse model of the atopic eczema/dermatitis syndrome by repeated application of a crude extract of house-dust mite Dermatophagoides farinae［J］. Allergy，2003，58(2):139－145.

［4］Yamashita H，Makinoa T， Mizukami H.Pharmacological characterization of a chronic pruritus model induced by multiple application of 2，4，6-trinitrochlorobenzene in NC mice［J］.Eur J Pharmacol，2007，563(1-3):233－239.

［5］Gao XK，Nakamura N，Fuseda K，et al.Establishment of allergic dermatitis in NC/Nga mice as a model for severe atopic dermatitis［J］.Biol Pharm Bull，2004，27(9):1376－1381.

［6］Okada M，Hirasawa Y，Yoshijima K，et al.Effects of clobetasol propionate，a coticosteriod on hapten-induced dermatitis in SPF NC/Nga mice［J］.Oyo Yakuri/Pharmacometrics，2000，59:135－139.

Establishment of Atopic Dermatitis Model with Nc/Nga Mice Sensitized and Challenged with DNCB

GUO Ya-nan，WEN Hai-quan
(Department of Dermatology，Central South University XiangYa Second Hospital，Changsha 410011，China)

Objective To determine the effect of DNCB in the Nc/Nga mice and to explore the ways of establishing AD models.Methods DNCB was repeatedly applied to the ear of NC/Nga mice.Atopic dermatitis-like skin lesions were evaluated by ear thickness，skin histology and immunological parameters.Results Repeated application of DNCB caused rapid increase in ear thickness.Clinical and histological symptoms(dermal and epidermal thickening，hyperkeratosis，parakeratosis and inflammatory cell infiltration)in this model were very similar to those in human atopic dermatitis.Serum IgE and IL-4 levels were elevated in this model compared with normal mice.Conclusions These results suggest that our model is useful for elucidating the pathogenesis of atopic dermatitis.

Atopic dermatitis;Model，animal;Nc/Nga mice

book=12,ebook=1

R758.23

A

1671-7856(2010)05-0012-03

2009-12-15

郭亚南(1976－)，男，博士，从事斯奇康治疗特应性皮炎的机理研究。

文海泉(1945－)，男，教授，博士生导师，主要从事炎症性皮肤病的研究。