不同浓度血府逐瘀汤含药血清对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

林 薇，赵锦燕，郑良朴，曹治云，陈旭征，叶蕻芝

(1.福建中医学院福建省高校中西医结合基础重点实验室(福建中医学院)，福州 350108; 2.福建中西医结合研究院，福州 350108)

研究报告

不同浓度血府逐瘀汤含药血清对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

林 薇1，2，赵锦燕1，2，郑良朴1，2，曹治云2，陈旭征2，叶蕻芝2

(1.福建中医学院福建省高校中西医结合基础重点实验室(福建中医学院)，福州 350108; 2.福建中西医结合研究院，福州 350108)

目的观察不同浓度血府逐瘀汤含药血清对大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移及侵袭的影响，以及其生成一氧化氮(NO)的情况。方法用MTT法观察VSMCs的增殖，Transwell小室法观察VSMCs的迁移、侵袭，并检测培养上清液一氧化氮(NO)的含量。结果与空白对照组比较，5%血府逐瘀汤组能显著促进VSMCs的增殖(P＜0.05)，20%，30%血府逐瘀汤组能显著抑制VSMCs的增殖(P＜0.05);与空白对照组比较，培养48 h的培养上清液中，血府逐瘀汤组的NO水平有显著升高(P＜0.01)，且与血府逐瘀汤含药血清的浓度有剂量依赖关系。结论低浓度(＜10%)血府逐瘀汤含药血清有促进 VASMCs增殖和迁移、侵袭的作用，高浓度(＞10%)血府逐瘀汤含药血清有抑制VASMCs增殖、迁移和侵袭的作用，其作用可能与上清液的NO水平有关。

血府逐瘀汤;血管平滑肌细胞;增殖;迁移;侵袭

血管平滑肌细胞是构成血管壁组织结构及维持血管张力的主要细胞成分，其粘附、铺展和迁移时导致血管重建发生发展的关键环节。其结构及功能的改变是导致高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后在狭窄等多种心血管病的细胞病理学基础。相关研究发现血府逐瘀汤既有促血管生成的作用［1］，又能预防经皮血管腔内成形术后再狭窄的作用。笔者通过实验观察不同浓度血府逐瘀汤含药血清对血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及NO浓度的变化，初步探讨其作用机理。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

SD大鼠12只，6周龄，体重150±20 g，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物批号:0037614，SPF级，经福建中医学院实验动物中心清洁级动物房饲养［SYXK(闽)2005－0004］，自由饮水，普通饲料喂养，适应性饲养3 d。

1.2 药物制备

血府逐瘀汤中各药量为:当归9 g，生地黄9 g，桃仁12 g，红花9 g，枳壳6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g，购自福建中医学院国医堂药房。该方水煎2次，煎液过滤，混合后加热浓缩至含生药量1.3 g/mL，4℃保存备用。

1.3 试剂及设备

DMEM高糖培养液、南美胎牛血清、胰蛋白酶－EDTA、磷酸盐缓冲液 (美国Hyclone公司);明胶，戊巴比妥钠(Pentobarbital Sodium)(美国，SIGMA公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) (美国Amresco公司);boyden小室(江苏省海门市麒麟医用仪器厂);培养瓶、培养板 (美国，Corning公司);一氧化氮(NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);半自动生化分析仪(意大利生物技术公司);超净工作台(江苏苏州净化设备公司);CO2培养箱(德国，Heraeus公司);IX70倒置相差显微镜及数码摄像装置(日本，OLYMPUS公司)。

1.4 含药血清制备

血府逐瘀汤组(XFZYD)分别用中药6.5 g/kg灌胃，空白对照组(control)用6.5 g/kg生理盐水灌胃，每日2次，连续灌胃7 d，于第7天灌胃2 h后，以3%戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置1 h后，3000 r/min离心15 min分离血清，经56℃、30 min灭活后，用0.22 μm过滤除菌，置－20℃保存。

1.5 大鼠血管平滑肌细胞培养

大鼠平滑肌细胞(麦莎生物技术公司)，用含10%FBS的 DMEM高糖培养液，置于 37℃、5% CO2培养箱培养。

1.6 MTT实验

静止的大鼠血管平滑肌细胞以1×104个/mL的密度悬浮于10%FBS DMEM高糖培养液中，接种于96孔板中，培养24 h后，分别用5%、10%、20%、30%的血府逐瘀汤含药血清和空白对照血清干预。于37℃、5%CO2培养箱中分别培养12、24、36、48 h后，加入MTT溶液10 μL(终浓度5 mg/mL)，孵育4 h后弃去上清液，加入100 μL DMSO，振荡10 min后，于酶标仪上570nm检测吸光度(A)。

1.7 迁移实验

静止的大鼠血管平滑肌细胞悬浮于无血清DMEM高糖培养液中，培养体系为5%、10%、20%、30%的血府逐瘀汤含药血清和空白对照血清。于37℃、5%CO2培养箱中分别培养48 h后，收集细胞培养上清液将其置于boyden小室的下室，中间置以孔径8 μm的聚碳酸酯膜，上室加入静止的大鼠血管平滑肌细胞2×104个，于37℃、5%CO2培养箱中培养1 h。聚碳酸酯膜上膜的细胞以棉签轻轻刮去，下膜以中性甲醛固定，苏木素常规染色，400×视野随机计数6个视野细胞数。

1.8 侵袭实验

Boyden小室中间置以孔径8 μm的0.5%明胶包被24 h的聚碳酸酯膜，其他步骤同迁移实验。

1.9 NO含量的检测

收集细胞培养上清液，参照试剂盒说明书进行含量测定。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度血府逐瘀汤对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

与空白对照组比较，5%、10%血府逐瘀汤含药血清作用12 h、24 h时，对大鼠血管平滑肌细胞增殖没有显著影响;作用36 h、48 h时，可显著促进大鼠血管平滑肌细胞增殖(P＜0.05);20%、30%血府逐瘀汤含药血清作用12 h、24 h时，均不能抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖;作用36 h时，均可抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖(P＜0.05)(表1)。

表1 各组吸光度值的比较(n=8)Tab.1 The absorb value of various groups(n=8)

2.2 不同浓度血府逐瘀汤对大鼠血管平滑肌细胞迁移、侵袭的影响

与空白对照组比较，5%的血府逐瘀汤含药血清干预后，迁移、侵袭到下层膜的细胞数有显著升高(P＜0.05);10%的血府逐瘀汤含药血清干预后，迁移到下层膜的细胞数有显著升高(P＜0.01)，侵袭到下层膜的细胞数无明显变化;20%、30%的血府逐瘀汤含药血清干预后，迁移、侵袭到下层膜的细胞数均有显著升高(P＜0.01)(表2)。

表2 各组迁移、侵袭到下层膜的细胞数的比较(n=6)Tab.2 The migration and invasion assay of various groups(n=6)

2.3 血府逐瘀汤对培养上清液NO的影响

与空白对照组比较，各浓度的血府逐瘀汤含药血清培养细胞48 h的上清液中NO水平都有显著升高(P＜0.01)，且与血府逐瘀汤含药血清的浓度有剂量依赖关系(表3)。

表3 各组培养上清液NO含量的比较(n=6)Tab.3 The NO in supernatant various groups(n=6)

3 讨论

血府逐瘀汤出自清代王清任《医林改错》，具有疏肝理气、活血化瘀功效，原著论述可治20种瘀血之证，是目前在血瘀证应用中最具有代表性临床方剂。血清药理学方法被广泛地应用于中药的药理学研究，适合在细胞、亚细胞、分子水平对中药及中药复方进行深入的机制研究［2］。新生内膜形成是局部血管损伤的一种过修复反应，在高血压、动脉粥样硬化、冠脉搭桥术后移植血管及血管成形术后局部血管的再狭窄等多种损伤性血管疾病的病理过程中均扮演重要角色，众多血管活性物质及生长因子均参与其复杂生物学过程。新生内膜形成与血管重塑之间的稳态失衡是导致血管再狭窄的重要因素，从血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖等方面探讨新生内膜形成和再狭窄的分子机制已成为目前研究的热点［3，4］。本实验应用血府逐瘀汤含药血清干预大鼠血管平滑肌增殖、迁移及侵袭，结果表明5%血府逐瘀汤含药血清对大鼠血管平滑肌增殖、迁移及侵袭有显著的促进作用，20%和30%血府逐瘀汤含药血清对其有显著的抑制作用。研究提示血府逐瘀汤可能是通过抑制血管平滑肌增殖、迁移或者侵袭来抑制血管成形术后局部血管的再狭窄的发生，或者抑制动脉粥样硬化斑块的形成;同时血府逐瘀汤也有可能是通过促进血管平滑肌细胞增殖、迁移或者侵袭来参与到新生内膜形成，这两者间平衡调节有待于进一步的研究。

血管内皮损伤所引发的血管平滑肌细胞(VSMCs)粘附、增生及向内膜下迁移，其机制非常复杂，众多的细胞因子参与其中，但迄今尚未明确其作用机理［5，6］。NO是血管内皮分泌的最重要的一种内皮源性血管活性因子，在许多血管病变的病理生理过程中起着重要的作用［7］，具有广泛的生物学效应。近年发现它在肿瘤研究中发现NO的水平是其作用机制的关键因素，且NO对肿瘤的发生、发展有促进和抑制的双向调节作用［8］;在调节血管SMCs增殖、凋亡、迁移及血管基质形成方面也具有重要作用［9］。本实验结果表明不同浓度的大鼠血管平滑肌细胞的培养上清液中NO的含量有显著变化，且与血府逐瘀汤含药血清的浓度有剂量依赖关系，从而推测 NO浓度可能是其调节作用的关键。NO在血管SMCs增殖、凋亡、迁移及血管基质形成方面是否也具有促进和抑制的双向调节作用以及如何通过 NO水平来发挥作用有待进一步深入研究。

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Effect of Different Concentration of XueFuZhuYu Decoctions on Proliferation，Migration and Invasion of Vascular Smooth Muscle Cells in Rats

LIN Wei1，2，ZHAO Jin－yan1，2，ZHENG Liang－pu1，2，CAO Zhi－yun2，CHEN Xu－zheng2，YE Hong－zhi2
(1.Fujian Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China; 2.Fujian Academy of Integrative Medicine，Fuzhou 350108，China)

ObjectiveTo observe effect and nitrogen monoxidum of different concentrations XueFuZhuYu decoction on proliferation，migration and invasion of vascular smooth muscle cells in rats。MethodsMTT assay was used to view proliferation of VSMCs.Cell migration and invasion was determined by Transwell assay，contents of nitrogen monoxidum in supernatant were detected。ResultsCompared with blank group，5%XueFuZhuYu Decoction could promote proliferation，migration and invasion(P＜0.05)，20% and 30% XueFuZhuYu decoction could inhibit proliferation，migration and invasion(P＜0.05).Contents of nitrogen monoxidum in all dose groups were significantly elevated after culturing 48 hours(P＜0.01)。Conclusions Low concentration(＜10%)serum containing XueFuZhuYu decoction could promote proliferation，migration and invasion，high concentration(＞10%)could inhibit proliferation，migration and invasion.The effect was related with contents of nitrogen monoxidum.

XueFuZhuYu decoction;Vascular smooth muscle cells;Proliferation;Migration;Invasion

R－33

A

1671－7856(2010)05－0057－04

2009－12－17

福建省自然基金资助课题(2009J01173)，福建省中西医结合老年性疾病重点实验室开放课题(CKJ2008061)。

林薇(1974－)，女，助理研究员，主要从事生化与免疫的研究。

叶蕻芝(1968－)，女，副研究员。E－mail:yelin0930@163.com