D－半乳糖致衰老模型大鼠肝肾功能和自由基代谢与中药的干预作用

艾秀峰，陈民利，潘永明，朱科燕，肖 慧，余 佳，谢日青，冷晓霞，陶 涛

(浙江中医药大学实验动物研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

研究报告

D－半乳糖致衰老模型大鼠肝肾功能和自由基代谢与中药的干预作用

艾秀峰，陈民利，潘永明，朱科燕，肖 慧，余 佳，谢日青，冷晓霞，陶 涛

(浙江中医药大学实验动物研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053)

目的 观察D－半乳糖致衰老模型大鼠血糖血脂、肝肾功能和自由基代谢的变化，探讨中药的干预作用及其抗衰老的机制。方法大鼠每日皮下注射D－半乳糖，连续造模7周，建立大鼠衰老模型，造模同时，用抗衰老片和首乌延寿片进行干预，测定试验大鼠的血糖血脂、肝肾功能和 SOD、MDA、Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase等自由基代谢指标。结果造模7周后，模型对照组衰老大鼠 TG、BUN明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，AST、ALP、CREA呈上升趋势(P＞0.05)，肝、肾组织SOD活性明显降低(P＜0.05)，肾组织MDA含量明显升高(P＜0.05)，肝组织Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase活性均显著降低(P＜0.05，P＜0.01);给予抗衰老片和首乌延寿片后，衰老大鼠TG、AST、BUN、CREA和UA均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，肝、肾组织MDA含量显著降低(P＜0.05)，SOD活性显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，肝组织 Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均显著升高(P＜0.01)。结论D－半乳糖致衰老大鼠模型的血脂上升、肝肾功能异常和抗脂质过氧化的能力下降;给予抗衰老片和首乌延寿片后，可有效改善衰老大鼠的糖脂代谢和肝肾功能，提高肝肾组织的抗脂质过氧化的能力，提示中药的抗衰老作用可能与其抗氧化作用有关。

D－半乳糖;衰老大鼠;肝肾功能;自由基;中药

随着人类物质文明和生活水平的不断提高，人的寿命普遍延长，人类社会开始步入老龄化。随着衰老的进程，抗病能力减弱，为老年病的发生奠定了病理基础。同时老年病的产生和发展，加速衰老的进程，形成恶性循环，因此衰老与抗衰老成为当今世界医学研究的热点。现代西医学对衰老的发生发展还缺乏有效控制手段，而中医自古注重延年益寿的养生之道，以整体观念和辨证论治认识疾病的本质，通过各种中药方剂来恢复被破坏的整体平衡，从而达到治愈疾病的目的。衰老的生理特征主要表现为肝肾等组织的功能障碍，自由基代谢增多和血糖血脂等的代谢紊乱［1－3］，抗衰老片和首乌延寿片等中药抗衰老已在临床上得到广泛的应用［4］，但对药理实验研究至今报道甚少，其抗衰老机理尚不明确。本实验采用 D－半乳糖诱导衰老大鼠模型［5，6］，观察其血糖血脂，肝肾功能和自由基代谢的改变，并进行抗衰老片和首乌延寿片干预，探讨中药抗衰老的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及饲养环境

SPF级Wistar大鼠，48只，雌雄各半，体重:雌200～220 g，雄240～260 g，由中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物公司提供［SCXK(沪) 2007～0005］，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障系统内［SYXK(浙)2003～0003］。

1.2 试验药物及其配制

抗衰老片(浸膏粉):批号080320，临用前用蒸馏水溶解至浓度30 mg/mL;首乌延寿片:批号为A060801，临用前用蒸馏水溶解至浓度52.5 mg/mL。

1.3 主要试剂

D－半乳糖，批号:20071115，上海恒信化学试剂有限公司(原上海试剂二厂);超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)及ATP酶试剂盒，批号: 20080717，南京建成生物工程研究所;尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿酸(UA)等测试试剂盒，批号分别为310/ 038/1、171/021/2、10384/46681/5、10385/46621/4、9749/46387/1、250/027/1、10194/46909/1，上海申能－德赛诊断技术有限公司。

1.4 主要仪器

AF100雪花状制冰机，美国SCOTSMAN;Allegra X－15R大容量离心机，美国贝克曼公司;日立7020全自动生化分析仪，日立公司。

1.5 造模与给药

用皮下注射 D－半乳糖建立大鼠衰老模型［5，6］，取Wistar大鼠48只，适应性饲养1周，观察有无异常情况，然后将大鼠称重，编号，按体重随机分成4组，每组12只，雌雄各半，按3只/笼饲养，自由进食饮水。除正常对照组外，其余各组每日一次颈背部皮下注射5%D－半乳糖生理盐水溶液，剂量为100 mg/kg，连续造模7周。从造模第1天开始给药，抗衰老片组经口灌胃给予 0.30 g/kg剂量的抗衰老片，首乌延寿片组经口灌胃给予0.525 g/kg剂量的首乌延寿片，模型对照组和正常对照组每日一次经口灌胃给予蒸馏水10 mL/kg，连续给药7周。

1.6 生化指标测定

1.6.1 血清肝肾功能和血糖血脂测定:动物处死前，先进行尾静脉取血 1 mL，3000 r/min离心 10 min，分离血清，测定AST、ALT、ALP、BUN、CREA、UA等肝肾功能指标和血糖(GLU)、血脂(TG、TC)。

1.6.2 肝、肾组织自由基代谢指标的测定:分别取部分肝、肾组织，用滤纸吸干水分后称重，迅速放入盛有碎冰块的小烧杯中冰浴，按组织重量体积比加预冷的生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000 r/min离心15 min，然后取组织匀浆上清再用生理盐水稀释成所需浓度，－70℃保存，待测。按试剂盒说明书分别测定肝、肾组织SOD活性和MDA含量，测定肝组织中的Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性，测定方法严格按照试剂盒说明书步骤进行。

1.7 统计学处理

所有计量数据均表示为均数 ±标准差，采用SPSS11.0软件进行统计分析，检验方法采用 One－Way ANOVA分析和Dunnett－t检验。

2 结果

2.1 D-半乳糖致衰老大鼠的血糖血脂代谢与中药干预的影响

与正常对照组比，模型对照组衰老大鼠 TG有明显升高(P＜0.05)，TC有上升趋势，但差异不显著(P＞0.05);给予抗衰老片和首乌延寿片后，均不同程度降低衰老大鼠 TG和 TC，与模型对照组比，各给药组TG降低显著(P＜0.05)，模型对照组和各给药组的GLU均无明显变化(表1)。

2.2 D-半乳糖致衰老大鼠的肝肾功能与中药干预的影响

与正常对照组比，模型对照组衰老大鼠肝肾功能指标中血清 BUN明显上升(P＜0.01)，血清AST、ALP、CREA呈上升趋势(P＞0.05)，ALT和UA未见明显变化;而给予抗衰老片和首乌延寿片后，衰老大鼠血清AST、BUN、CREA和UA水平均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，血清ALP、ALT亦有下降趋势(P＞0.05)(表2)。

表1 D－半乳糖致衰老大鼠的糖代谢和脂代谢与中药干预的影响(n=12)Tab.1 The glucose metabolism and lipid metabolism of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

表2 D－半乳糖致衰老大鼠的肝肾功能与中药干预的影响(n=12)Tab.2 Liver and renal function of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

2.3 D-半乳糖致衰老大鼠肝肾组织中的 SOD活性和MDA含量及中药干预的影响

与正常对照组比，模型对照组衰老大鼠肝肾组织SOD活性明显降低(P＜0.05)，肾组织MDA含量明显升高(P＜0.05);肝组织MDA含量亦有升高趋势(P＞0.05)。给予抗衰老片和首乌延寿片干预后，衰老大鼠肝肾组织SOD活性和MDA含量均有不同程度地改善，其中，抗衰老片组大鼠肝肾组织MDA含量明显下降(P＜0.05)，肾组织SOD活性明显升高(P＜0.05)，肝组织SOD活性亦有升高趋势(P＞0.05);首乌延寿片组大鼠肝肾组织SOD活性升高显著(P＜0.05、P＜0.01)，MDA含量明显下降(P＜0.05)(表3)。

2.4 D-半乳糖致衰老大鼠肝组织 Na+-K+-ATPase和Ca++-Mg++-ATPase活性与中药干预的影响

与正常对照组比，模型对照组衰老大鼠肝组织Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均显著降低(P＜0.05，P＜0.01);给予抗衰老片和首乌延寿片干预后，衰老大鼠肝组织 Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase 活 性 均 显 著 提 高 (P ＜0.01)(表4)。

表3 D－半乳糖致衰老大鼠肝肾组织SOD活性和MDA含量与中药干预的影响(n=12)Tab.3 SOD activity and MDA content of liver and renal tissue of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

表4 D－半乳糖致衰老大鼠肝组织Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase活性与中药干预的影响(n=12)Tab.4 Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPase activities of liver tissue of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

3 讨论

衰老的自由基理论认为机体随着年龄增大的退行性变是由于受到内、外环境的影响以及机体抗氧化酶的活性不断下降使体内自由基物质过剩的结果［7］。机体衰老时，体内组织细胞中的自由基代谢失去平衡，自由基反应异常或失控时会使体内大分子物质产生氧化效应，如生物膜磷脂和不饱和脂肪酸受自由基攻击后形成丙二醛(MDA)，再和蛋白质交联形成脂褐质，引起细胞和组织的损害，造成衰老［8］。D－半乳糖致衰老是因其代谢产物半乳糖醇不能被进一步代谢而堆积，影响了细胞的渗透压，导致细胞肿胀，代谢紊乱。同时，体内自由基增多，脂质过氧化加深，抗氧化酶活性降低［9］，最终引起组织细胞的功能障碍，组织受损。本研究采用连续皮下注射D－半乳糖致大鼠衰老模型，造模后大鼠血脂上升、肝肾功能异常、抗脂质过氧化的能力下降，与文献报道相一致［10］，适合于衰老机制和抗衰老药物的研究。

高脂血症是引起动脉硬化，继发高血压、冠心病、脑卒中等严重心脑血管疾病病变的主要原因［11］，而老年人血清脂质和脂蛋白、血糖水平有随年龄增长而增高的倾向［12］。本研究结果显示，造模7周后，模型对照组衰老大鼠血清TG明显升高，TC亦有上升趋势，给予抗衰老片和首乌延寿片干预后，均不同程度降低衰老大鼠 TG和 TC，表明抗衰老片和首乌延寿片等中药可以有效降低衰老大鼠血清TG，减少老年高脂血症等疾病的发生。

研究表明，衰老大鼠肝肾组织发生退行性变化［13］，进而影响肝肾组织代谢水平，导致肝肾功能下降。ALT、AST和ALP是肝组织酶谱中含量丰富的酶系，肝脏受损时，可因细胞通透性增加、细胞坏死等，使血清酶量发生变化。酶学检测已作为肝病诊断、鉴别诊断、预后诊断及治疗评价的重要依据。血清中BUN、C r及UA是目前临床评价肾功能的重要指标［14］。本研究结果发现，造模7周后，模型对照组衰老大鼠血清BUN含量明显上升，血清AST、ALP、CREA、UA亦呈上升趋势，给予抗衰老片和首乌延寿片干预后，均显著降低衰老大鼠血清AST，均不同程度降低衰老大鼠血清 ALP、CREA、BUN和UA水平，ALT亦有下降趋势，提示抗衰老片和首乌延寿片等中药可以有效改善衰老大鼠的肝肾功能。

机体衰老过程中，组织细胞中的自由基代谢失去平衡，过多的自由基攻击生物膜使体内大分子物质产生氧化效应，如生物膜磷脂和不饱和脂肪酸形成丙二醛(MDA)，再和蛋白质交联形成脂褐质，引起细胞和组织的损害，加速衰老［8］。超氧化物歧化酶(SOD)是机体抗氧化防御系统的主要酶系之一，可以特异地清除自由基，保护组织细胞免受损伤。加速细胞衰老和死亡。本研究结果发现，造模7周后，衰老大鼠肝、肾组织SOD活性明显降低，肾组织MDA含量明显升高，给予抗衰老片和首乌延寿片干预后，抗衰老片组大鼠肝、肾组织MDA含量明显下降，肾组织SOD活性明显升高，首乌延寿片组大鼠肝、肾组织 SOD活性显著升高，MDA含量显著降低，提示抗衰老片和首乌延寿片等中药可以有效改善衰老大鼠的自由基的代谢紊乱，抑制体内自由基生成，减少膜脂质过氧化，从而减少细胞氧化损伤的发生，延缓细胞衰老和死亡。

自由基可直接氧化膜脂质形成大量过氧化脂质，与 ATP酶蛋白氨基酸残基，使 Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase活性降低，影响细胞内Na+及Ca++的分布，导致 Ca++超载［15］，加速细胞衰老和死亡。本研究结果显示，衰老大鼠肝组织 Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均显著降低，给予抗衰老片和首乌延寿片干预后，衰老大鼠肝组织Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均显著提高，进一步说明抗衰老片和首乌延寿片可以提高肝组织的抗脂质过氧化的能力，提示抗衰老片和首乌延寿片等中药的抗衰老作用可能与其抗氧化作用有关。

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Liver and Renal Function and Free Radical Metabolism of Ageing Rat Model Induced by D-galactose and Interventional Effect of Traditional Chinese Medicine

AI Xiu－feng，CHEN Min－li，PAN Yong－ming，ZHU Ke－yan，XIAO Hui，YU Jia，XIE Ri－qing，LENG Xiao－xia，TAO Tao
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center，Hangzhou 310053，China)

ObjectiveTo observe the changes of glucose and lipid metabolism，the liver and renal function and the free radical metabolism of ageing rat model induced by D－galactose and to study the effect of traditional Chinese medicine on anti－ageing mechanism. Methods The ageing rat model was established by injecting D－galactose subcutaneously every day for seven weeks，meanwhile the rats in administration groups were given anti－ageing tablets and Shouwu Yanshou tablets respectively.At the end of the experiment，the glucose and lipid metabolism，the liver and renal function and SOD，MDA，Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPase were determined。ResultsAfter seven weeks，TG and BUN of the ageing rat in model control group significantly increased(P＜0.05，P＜0.01)，the content of serum AST，ALP and CREA increased(P＞0.05)，SOD activity of the liver and renal tissue decreased significantly(P＜0.05)，the content of MDA of the renal tissue increased obviously(P＜0.05)，the Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPaseactivities of the liver tissue descended remarkably(P＜0.05，P＜0.01).After treatment of anti－ageing tablets and Shouwu Yanshou tablets，the content of serum TG，AST，BUN，CREA and UA significantly suppressed(P＜0.05，P＜0.01)，the content of MDA of liver and renal tissue of ageing rats decreased remarkably(P＜0.05)，SOD activity increased remarkably(P＜0.05，P＜0.01)，the Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPase activities of the liver tissue ascended remarkably(P＜0.01)。Conclusions The content of blood lipid of ageing rat model induced by D－galactose increases，the liver function and renal function are abnormal，the capability of anti－lipid peroxidation decreases，anti－ageing tablets and Shouwu Yanshou tablets can improve effectively the glucose and lipid metabolism and the liver and renal function，and enhance the capability of anti－lipid peroxidation of liver and renal tissue，which suggest that the anti－ageing effect of traditional Chinese medicine may be related to their antioxidation.

D－galactose;Ageing rat;Liver and renal function;Free radical;Traditional Chinese medicine (TCM)

R332;R285.5

A

1671－7856(2010)05－0041－05

2009－12－24

浙江省中医“治未病”研究专项(2007WB022);“浙江省卫生高层次创新人才培养工程项目”资助。

艾秀峰，男，硕士生。

陈民利(1963－)，女，教授、硕导，研究方向:比较医学。E－mail:minlichen01@yahoo.com.cn