线性扫描伏安法测定维生素B2

沈峥 习霞 明亮

1 无锡高等师范学校 江苏无锡 214001 2 南通大学化学化工学院 江苏南通 226019

1 前言

维生素B2（Vitamine B2，简写为VB2），又称核黄素，化学结构式如图1所示，它是黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的重要组成部分，而FMN和FAD是生物体内的重要辅酶，具有催化生物氧化还原的功能，参与生物体内的许多重要代谢活动 。同时维生素B2也是常用药物，广泛用于食品、医药和生化等领域。因此，建立灵敏、可靠、简便的维生素B2测定方法具有重要的实际意义。目前测定维生素B2的方法主要有分光光度法[1]、荧光法[2]以及电化学分析方法[3-4]等。

图1 维生素B2的化学结构

碳纳米管是20世纪90年代初发现的一种具有独特电学性能、大比表面积、强吸附性及高稳定性的新型碳结构，分单壁碳纳米管（SWCNT）和多壁碳纳米管（MWCNT）两类。碳纳米管因其优异的性能而成为众多领域的研究热点[5-6]。碳纳米管用作电极材料可以加速物质的电子交换[7]，因此成为电化学方法的新型材料。本文将多壁碳纳米管修饰在玻碳电极上，研究维生素B2在该修饰电极上的电化学行为，发现该修饰电极对维生素B2产生明显的电催化作用，从而建立一种简便、快速、灵敏的直接测定维生素B2的电化学分析方法。

2 实验部分

2.1 主要仪器与试剂

CHI660A型电化学工作站（上海辰华仪器公司），采用三电极体系：多壁碳纳米管修饰玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl（饱和KCl溶液）电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

多壁碳纳米管（MWCNT）由南京大学化学化工学院生命分析化学教育部重点实验室提供，采用催化裂解的方法制备，并按文献[8]方法进行纯化；双十六烷基磷酸（DHP，瑞士Fluka公司）、维生素B2（生化试剂，上海试剂二厂）、维生素B2片(南京白敬宇制药有限公司，规格5 mg)，所用化学试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

2.2 MWCNT修饰玻碳电极的制备

将5 mg MWCNT和5 mg DHP加入5 mL二次蒸馏水中，超声分散20 min直至得到1 mg·mL-1浅黑色的MWCNT-DHP悬浮液。玻碳电极（有效直径3 mm）依次用0.3、0.05 μm氧化铝粉及麂皮抛光至镜面，然后依次在无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗3 min，红外灯下烘干。用微量进样器取MWCNT-DHP悬浮液15 μL滴加在玻碳电极表面，红外灯下挥发掉溶剂即制得MWCNT修饰玻碳电极。

2.3 分析步骤

MWCNT修饰玻碳电极先在10 mL 0.1 mol·L-1邻苯二甲酸氢钾（pH：4.0）中经循环伏安扫描活化（0.00～-0.80 V），直至循环伏安曲线稳定为止。然后加入一定量的维生素B2标准溶液，通氮气除氧10 min，在搅拌条件下开路富集3 min后，静止30 s，用线性扫描伏安法（LSV）进行测定。每次测定后，电极在空白底液中于1.2 V恒电位电解900 s以除去吸附在表面的维生素B2，从而恢复其催化活性。所有实验均在室温下进行。

3 结果与讨论

3.1 维生素B2在MWCNT修饰电极上的电化学行为

用循环伏安法研究1.0×10-5mol·L-1维生素B2在MWCNT修饰玻碳电极上的电化学行为，其循环伏安曲线如图2所示。由图可知，MWCNT修饰玻碳电极在邻苯二甲酸氢钾缓冲液中未观察到任何氧化还原峰（曲线a）。当加入1.0×10-5mol·L-1维生素B2后，在0.00～－0.80 V的阴极扫描过程中，于－0.317 V出现一灵敏度高、峰形较好的还原峰；在反向扫描时，于－0.222 V出现一灵敏度高、峰形较好的氧化峰（曲线b）。而与之形成鲜明对比，维生素B2在裸玻碳电极上未观察到明显的氧化还原信号（图未给出），这是因为MWCNT具有独特的电化学性质和大比表面积，为维生素B2的氧化还原提供了很多的反应位点，从而使电子交换变得容易，氧化还原峰电流显著提高。由于维生素B2在MWCNT修饰玻碳电极上的还原峰比氧化峰更为灵敏，因此在接下来的研究中选择还原峰来定量测定维生素B2。

随着循环扫描次数的增加，维生素B2的氧化还原峰电流逐渐降低。当以100 mV·s-1的扫速扫描3圈后，氧化还原峰电流趋于稳定，说明反应物或者其反应产物在修饰电极表面发生吸附，使电极表面有效的反应位点降低，从而导致氧化还原峰电流降低。

图2 MWCNT修饰玻碳电极在pH为4.0的邻苯二甲酸氢钾缓冲液中的循环伏安曲线

3.2 测定底液的选择

利用线性扫描伏安法研究1.0×10-5mol·L-1维生素B2在pH值为1.0的盐酸溶液、pH值为4.0的邻苯二甲酸氢钾、pH值为9.2的硼砂溶液、pH值为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液以及pH值为4.0～6.0的醋酸—醋酸钠缓冲液（浓度均为0.1 mol·L-1）中的电化学行为。结果表明：在0.1 mol·L-1邻苯二甲酸氢钾（pH：4.0）缓冲溶液中，维生素B2的还原峰峰形最好，峰电流最高，因而在实验中以此电解质作为最佳测定底液。

图3 1.0×10-5 mol·L-1维生素B2在MWCNT修饰玻碳电极上以不同时间的循环伏安曲线

3.3 修饰剂用量的影响

MWCNT膜能显著提高维生素B2氧化还原峰电流。但实验表明，修饰电极表面的MWCNT-DHP复合膜的厚度（由滴加到玻碳电极表面的MWCNT-DHP悬浮液的用量决定）对维生素B2的氧化还原峰电流有很大的影响。当悬浮液用量从0逐渐增加到10 μL时，氧化还原峰电流显著增加，这是因为随着电极表面的MWCNT量的逐渐增加，维生素B2在电极表面的富集效率也相应提高，对维生素B2氧化还原的催化活性也随之增加，最终导致氧化还原峰电流也增加。当用量进一步增加时，氧化还原峰电流变化缓慢，但是当用量超过20 μL时，氧化还原峰电流反而逐渐缓慢降低，这是因为此时电极表面的DHP太多，膜的厚度增大，其绝缘效应降低了MWCNT-DHP复合膜的导电性能，并阻碍了维生素B2的传质和与电极之间的电子交换，而且挥发溶剂也需要更长的时间。所以本实验采用15 μL的1 mg·mL-1的MWCNT-DHP悬浮液来制备化学修饰电极。

3.4 富集电位和时间的影响

当富集电位从0.40～－0.40 V时，氧化还原峰电流几乎不变，这说明富集电位对维生素B2在MWCNT修饰玻碳电极上的电化学氧化过程几乎没有影响，所以本实验选择开路富集。

在选定的富集电位下考察富集时间变化对维生素B2还原峰电流的影响。结果表明，在富集时间从0增加到3 min的过程中，还原峰电流几乎线性增加；当超过3 min时，峰电流增加缓慢，进入平台区，说明此时维生素B2在修饰电极表面吸附达到饱和。本实验选用3 min的富集时间以提高分析灵敏度及缩短分析时间。

3.5 扫描速度的影响

如图3所示，在100～300 mV·s-1的扫速范围内，1.0×10-5mol·L-1维生素B2的氧化还原峰电流与扫描速度存在良好的线性关系，这进一步表明维生素B2在此修饰电极上的电极反应是受吸附控制的。由于随着扫描速度增大，充电电流必将增大，不利于峰电流的测定。为了获得较好的信噪比，在获得较大峰电流的同时又要防止充电电流过大，本实验最终选用100 mV·s-1的扫描速度。

3.6 线性范围、检出限及电极重现性

在上述优化的实验条件下利用线性扫描伏安法研究维生素B2还原峰电流与浓度的关系。图4中标准曲线显示维生素B2的还原峰电流ip（µA）与其浓度C（µmol·L-1）在3.0×10-6～2.0×10-5mol·L-1的范围内呈现良好的线性关系，其回归方程为：ip＝－0.652 9＋0.854 8C，（r＝0.999 0）。当浓度高于2.0×10-4mol·L-1时，还原峰电流随浓度增加而几乎不变，进一步说明维生素B2在该修饰电极表面发生吸附。开路富集3 min的检出限为1.0×10-6mol·L-1（按3倍信噪比估算）。每次测定后，将吸附了维生素B2的修饰电极置于pH值为4.0的邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液中，于1.2 V恒电位电解900 s后再用二次蒸馏水冲洗。清洗后的修饰电极，维生素B2的吸附峰消失，电极对维生素B2的电催化效果不变。更新的电极表面用于连续测定，在pH为4.0邻苯二甲酸氢钾缓冲液中，对1.0×10-5mol·L-1的维生素B2平行测定10次的相对标准偏差（RSD）为4.2%，说明此修饰电极具有很好的重现性。但是如果将修饰电极在维生素B2溶液中长时间扫描，维生素B2将在电极表面强烈吸附，且电极表面将生成一种聚核黄素膜[9]，这层膜的生成对电极的重现性将有影响。

此外还考察该修饰电极的使用寿命。将电极放置于空气中72 h再测，峰电流并不显著下降，表明电极暴露于空气中亦可保持其催化活性。修饰电极每天测定1次，然后在空白底液中电解于1.2 V恒电位电解900 s活化后存放在冰箱中，4周后对1.0×10-5mol·L-1维生素B2的测定信号仅下降5.8%，这表明该修饰电极具有良好的稳定性和较长的使用寿命。

图4 维生素B2在MWCNT修饰玻碳电极上的线性伏安曲线（内插图为标准曲线）

3.7 干扰实验

在优化实验条件下，利用线性扫描伏安法研究一些常见的生物小分子及药剂辅料对测定维生素B2的干扰。实验表明：500倍的葡萄糖、尿素，100倍的多巴胺、抗坏血酸、扑尔敏、茶碱、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁等，几乎不干扰1.0×10-5mol·L-1维生素B2的测定（误差＜3%），人体内常见的各种金属离子，如Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Fe2+等，也不影响维生素B2的测定。

3.8 样品分析

取市售维生素B2片（标示含量为每片50 mg）10片，研细、称量。准确称取相当于1片药片质量的粉末样品于100 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解并准确定容，静置12 h后取100 μL上层清液加入到9.9 mL邻苯二甲酸氢钾缓冲液（pH：4.0）中稀释待测。在选定的最佳条件下，利用线性扫描伏安法对其进行测定，根据标准曲线线性回归方程计算出维生素B2含量，同时将该方法与药典标准方法[1]进行对照实验，结果见表1。另外，在上述已知维生素B2含量的样品溶液中，加入1.0×10-5mol·L-1的维生素B2标准溶液，按上述条件进行加标回收实验，加标回收率在95.8%～103.5%之间。结果表明，此方法测定结果与标示量或药典标准方法测定结果均相符合，说明该分析方法具有很高的准确性，可用于实际样品中维生素B2含量的测定。

表1 维生素B2片剂中含量（标示量%）测定结果

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