树枝状聚赖氨酸的合成

董红霞,刘 卅,郭建维(广东工业大学轻工化工学院,广东广州,50006;2华南理工大学生物医学工程研究院,广东广州,5064;3广东省高性能与功能高分子材料重点实验室,广东广州,5064)

树枝状聚赖氨酸的合成

董红霞1,刘 卅2,3,郭建维1
(1广东工业大学轻工化工学院,广东广州,510006;2华南理工大学生物医学工程研究院,广东广州,510641;3广东省高性能与功能高分子材料重点实验室,广东广州,510641)

合成了一种具有精确分子结构的树枝状聚赖氨酸,并用1H-NMR&13C-NMR和ESI-M S和MALD I-TOFM S等手段对所得产物结构进行了表征。通过不同条件实验的方法对树枝状聚赖氨酸的合成条件进行了优化。结果表明,反应温度、切割时间和溶剂对产率的影响明显。优化后的反应条件是原料配比为NDi-Boc-赖氨酸:N己二胺=2∶1.0;冰水浴下反应2小时后温度升高至25℃继续反应24小时;保护基团切割时间为1.5小时。在优化的条件下,产物最高收率为80.2%。采用DM F作溶剂,效果优于DCM。

树枝状;合成;优化;表征

树枝状聚氨基酸的合成不仅具有很重要的理论意义,而且具有重要的应用价值。树枝状大分子是通过逐步合成的方法向核外增加多价层,树枝状大分子的物理尺寸变化范围很大,通常典型的是介于小分子和乳化粒子之间。树枝状大分子的多样性几乎是无限的,核的结构和层数、末端官能团[1]都可以变化使该类聚合物的分子尺寸、分子量、表面节点、分子对称性和亲水性具有多样性,所有这些性能对化学和药学性能都有影响。因此在各种工程领域的潜在用途变得相当广泛[2]。树枝状聚氨基酸的生物应用已经引起了广泛的关注,例如,多分支抗原肽的发展,作为制备磁共振成像[3]、造影剂的支架以及用作基因载体,因此在生物化学、分子生物学及化学生物学等领域具有广阔的应用前景。本实验研究了一种树枝状聚赖氨酸的合成方法,并对树枝状聚赖氨酸的合成条件进行了优化。

1 实验部分

1.1 主要试剂

Boc-L-Lys(Boc)-OH·DCHA:HPLC级,吉尔生化上海有限公司;1-羟基苯丙三氮唑(HOBT): HPLC级,吉尔生化上海有限公司;三氟乙酸(TFA):HPLC级,吉尔生化上海有限公司;苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)∶HPLC级,吉尔生化上海有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DM F)、三乙胺、无水乙醚、无水乙醇、二氯甲烷(DCM)、柠檬酸等试剂均为分析纯,市售。

1.2 合成路线

图1 树枝状聚赖氨酸的合成路线图Fig.1 Synthetic scheme for the p reparation of the Poly-L-lysine dendrimers

1.3 D i-Boc-树枝状聚赖氨酸的合成方法[4]

D i-Boc-树枝状聚赖氨酸是以己二胺作核在均相条件下逐步反应生成的。将Boc-L-Lys(Boc)-OH·DCHA、HOBT和HBTU在50℃真空干燥3h,干燥好后在50m l的三口瓶中按设定配比(质量比,下同)依次加入Boc-L-Lys(Boc)-OH· DCHA、三乙胺、HBTU和HOBT,最后加入己二胺,采用DM F或DCM作为溶剂。温度控制在0℃-35℃,通入氮气开始反应。反应结束后将制得的D i-Boc-树枝状聚赖氨酸进行减压蒸馏,以除去溶剂。再用过量10%的柠檬酸水溶液使其沉淀,过滤并用大量蒸馏水洗涤,得白色固体,最后用少量的乙醇将其溶解,并加入15倍的乙醚进行萃取,萃取三次后,真空干燥称重得第一代D i-Boc-树枝状聚赖氨酸。

1.4 保护基的切割方法

将上述干燥好的第一代D i-Boc-树枝状聚赖氨酸粗产品加入圆底烧瓶,开始通入氮气,并加入适量三氟乙酸(TFA)开始搅拌,室温下反应设定的时间。反应结束后,加入大量无水乙醚,离心收集沉淀为第一代产物。

第二代和第三代的合成方法与第一代一样,分别用已合成的第一代和第二代继续反应获得。

2 表征方法

树枝状聚赖氨酸的结构通过1H-NMR&13CNMR[5]、电喷雾电离源质谱(ESI-M S)和基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALD I-TOF M S)来表征。1H-NMR&13C-NMR谱用德国Burker公司的AVANCE D igital 400MHz NMR型波谱仪测定,TM S为内标,溶剂采用Cam bridge Isotope Laboratories Inc的氘代核磁试剂DM SO-d6。电喷雾电离源质谱(ESI-M S)用德国布鲁克公司Esquire HCT PLUS型液相色谱-质谱联用仪采用ESI离子源,溶剂采用ACN/H2O测定。基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALD I-TOF M S)用德国B ruker公司autoflex IIIsm artbean型MALD I-TOF质谱仪。

3 结果与讨论

树枝状聚赖氨酸是以己二胺作为起始核通过液相多肽合成法[6]合成的产物。D i-Boc-树枝状聚赖氨酸通过在柠檬酸水溶液中沉淀从混合物种分离出来,合成过程如图1所示。该法是用HBTU做缩合剂,加入HOBT以减少副反应并抑制消旋,加快反应速度提高产率[7]。为了确保完全反应,要求氨基酸和缩合剂过量。使用三乙胺目的是通过中和己二胺核的盐酸盐[8],这样得到D i-Boc-树枝状聚赖氨酸。最后我们用三氟乙酸将粗产品切割得到第一代产物DPLYS-G1。每一代聚赖氨酸的合成都通过1H-NMR、13C-NMR、ESI-M S或MALD I-TOFM S检测。每代产物都用质谱检测,所得分子量与理论值接近,说明产物纯度比较高。

3.1 合成条件的选择优化

3.1.1 反应温度的影响

采用DM F为反应溶剂,Boc-L-Lys(Boc)-OH· DCHA的投料量为1.0mmol(即528m g),NDi-Boc-赖氨酸∶N己二胺=2∶1.0,在冰水浴中反应两小时后,分别升温至25℃、35℃继续反应24小时,反应后切割时间为1.5小时。所得产率分别为80.2%、60.5%。通常情况下,温度每升高10℃,相应的反应速率也会增大约一倍,但当反应温度从25℃升高到35℃时,产率反而降低,这主要是由于温度过高,己二胺挥发较快,故采取在冰水浴下反应两小时后升温至25℃反应。

3.1.2 切割时间的影响

采用DM F为反应溶剂,Boc-L-Lys(Boc)-OH· DCHA的投料量为1.0mmo l(即528m g), NDi-Boc-赖氨酸∶N己二胺=2∶1.0,在冰水浴中反应两小时后升温至25℃继续反应24小时,反应后切割时间分别为1.0、1.5、2.0小时。所得产率分别为75.2%、80.2%、72.5%。实验发现在三氟乙酸作用下,经过1.5小时,即可大部分脱除,得到淡黄色液体。在使用三氟乙酸时,当脱除时间过长,反应液变成灰色粘稠液体,加入少量CH2C l2作溶剂,可以避免灰色液体的生成。保护基Boc的切割时间不足或超过1.5小时,产率均降低,这是由于切割时间太短不能完全切除干净,切割时间超过1.5小时,切割下来的Boc又与氨基结合,故切割时间为1.5小时为宜。

3.1.3 溶剂的影响

分别采用DM F和DCM为反应溶剂,Boc-L-Lys (Boc)-OH·DCHA的投料量为1.0mmol(即528m g),NDi-Boc-赖氨酸∶N己二胺=2∶1.0,在冰水浴中反应两小时后,分别升温至25℃继续反应24小时,反应后切割时间为1.5小时。所得产率分别为80.2%、76.2%。N,N-二甲基甲酰胺(DM F)与二氯甲烷(DCM)是多肽合成中常用的溶剂,但得到的产率不同,主要是因为DM F对羟基与Boc氨基酸的成酯反应有抑制作用,同时DM F对作用物和产物均具有溶解度高的优点而被广泛应用于多种反应系统中[9]。故采用DM F作溶剂,效果优于DCM。

3.2 树枝状聚赖氨酸的结构表征

从图2可以看出G1在1.71 ppm、1.43 ppm、1.255ppm分别出现了赖氨酸侧链的β、γ、δ质子特征峰,在3.68处出现了与肽键连接的α质子峰。在G2、G3的谱图中,这些峰变得更宽,内层侧链上的β、δ质子峰会向高场移动。这种现象极有可能是由于外层的赖氨酸对内层的赖氨酸的化学屏蔽效应引起的[10]。

从G1的1H-NMR谱图上可知3.68处出现了与肽键连接的α质子峰,由于第二代的赖氨酸与树枝状分子表面有共轭作用,所以这个峰向低场的4.20ppm移动。对于G3来讲,这两个峰移向低场的4.19ppm。

图2 DPLYS-G1的1HNMR谱图Fig.2 1H-NMR spectra of the DPLYS-G1in DM SO-d6

从图3、图4分析得知:G1:ESI(m/z,[M+ H]+)∶373.3;计算值:372。G2:ESI(m/z,[M +H]+)∶885.7,计算值:884。G3:MALD I-TOF (m/z,[M+H]+)∶1910.486,计算值:1908。质谱测定结果揭示了在缩合反应时,低代树枝状聚合物的表面氨基被完全取代了,每代产物末端氨基数量与理论值基本一致,所测分子量与理论值吻合。

图3 DPLYS-G1的电喷雾电离源质谱图Fig.3 ESIm ass spectra of the DPLYS-G1

图4 DPLYS-G3的基质辅助激光解析串联飞行时间质谱图Fig.4 MALD I-TOFm ass spectra of the DPLYS-G3

4 结论

(1)采用液相多肽合成法合成了以己二胺为核的一至三代新型D i-Boc-树枝状聚赖氨酸,并用TFA去除保护基。经1H-NMR和13C-NMR分析,产物峰明显;经质谱鉴定,确定目标产物为树枝状聚赖氨酸。

(2)反应温度、切割时间和溶剂对产率的影响明显。

(3)优化后的反应条件为,在冰水浴中反应两小时后升温至25℃继续反应24小时,切割时间为1.5小时,用DM F作溶剂。

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Syn thesis of Po ly-L-lysine Dendr im ers

DONG Hong-xia1,L IU Sa2,3,GUO Jian-w ei1
(1 Faculty of Chem ical Engineering&L ight Industry,Guangdong University of Techno logy,Guangzhou 510006, Guangdong,China;2 B iom edical Engineering Institute,South China University of Technology,Guangzhou 510641,Guangdong,China;3 Key Laboratory of H igh Perform ance and Functional Po lym ers, Guangdong p rovince,Guangzhou 510641,Guangdong,China)

Po ly-L-lysine dend rim ersw ith p recisemo lecu lar architecturesw ere syn thesized.The structuresof the p roductsw ere further characterized by1H-NMR,13C-NMR,ESI-M S andMALD I-TOFM S.Synthetic conditionsof Po ly-L-lysine dendrim erswere op tim ized asw ell.The resu lts show ed that the yield of the p roductwasobviously influenced by three factors,such as reaction temperature,Boc-removed tim e and solvent.The op tim ized reaction conditions are:p roportion of reactant dosage:NDi-Boc-Lysine:Nhexanediamine=2∶1.0(mo l/mo l);A fter the reaction m ixturewas stirred at icywater bathing for2 hours,and kep t up at room temperature for 24 hours;Boc-removed tim e=1.5 hours.Under the op tim ized conditions,the highest yield of the p roduct is 80.2%.In addition,DM F was found to be the better so lvent than DCM.

dend rim er;synthesis;op tim ization;characterization

2010-04-20

TQ 31