口腔鳞状细胞癌近红外拉曼光谱特征及其诊断价值研究

李一 文志宁 李龙江，3 李梦龙 张壮 高宁

（1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川 成都 610041；2.四川大学化学学院 分析化学教研室，四川 成都 610064；3.四川大学华西口腔医院 头颈肿瘤外科，四川 成都 610041）

口腔癌的发病率位居全身恶性肿瘤发病率的前10位，是威胁人类健康的主要疾病之一[1]。目前虽然出现了多种全新治疗方法，使患者治疗后的生存质量明显提高，但生存率却无明显改善[2]，术后转移和复发是患者死亡的主要原因。究其死亡根本原因在于早期诊断方法匮乏，错失了治疗的最佳时机。

研究[3]表明，拉曼光谱技术对构成人体的基本生化物质非常灵敏，通过光谱分析可以获得大量有关生化成分含量、构型构象、组成及构成比的信息。拉曼光谱技术在恶性肿瘤的诊断和治疗等方面已得到跨越式发展。应用拉曼光谱技术检测消化系统、乳腺、女性生殖系统等癌变细胞内生化物质的变化发现，通过组织细胞光谱特征的检测可有效地在微观水平反映组织形态学的细微变化，为癌症的早期诊断提供强大的理论依据[4-7]。本研究采用近红外拉曼光谱技术及化学计量法，对口腔正常黏膜、白斑（oral leukoplakia，OLK）及口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）组织标本内组织及细胞生化物质的变化进行检测，应用径向基核函数支持向量机对不同病变进行分类建模，并验证其分类准确性和稳定性，以了解口腔黏膜细胞恶性转化过程中的光谱学变化规律，为应用拉曼光谱技术早期诊断口腔黏膜恶性病变奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 临床资料

收集2006年1月—2007年12月在四川大学华西口腔医院颌面外科进行治疗的30例口腔黏膜白斑患者和20例口腔鳞状细胞癌患者的病理切片，所有病理切片均根据《世界卫生组织肿瘤病理学和遗传学》（2005年版）[8]诊断。同时收集10例人群的口腔正常黏膜组织，常规固定，石蜡包埋。

对每一标本连续切片，厚度为5 μm，随机选取相邻2张并贴片。其中1张切片以苏木素－伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，邀请四川大学华西口腔医院经验丰富的2位病理学家及1位头颈肿瘤外科医生，将HE切片置于光学显微镜下进行会诊，精确定位黏膜白斑及鳞状细胞癌所在区域，并在切片上标示；另1张切片于定制的CaF2晶片上贴片，常温下风干后，以纯二甲苯脱蜡30 min，浸入95%乙醇内洗涤30 min，风干，对照HE切片，确定此切片的组织病理类型及相应病损区域。

1.2 傅立叶转换近红外拉曼光谱检测

采用Nicolet Nexus670型红外显微拉曼光谱仪（Nicolet公司，美国）对病损区域进行扫描，获得其特征性拉曼光谱。扫描的具体参数为：激光功率1 W，波长1 064 nm，波数范围100～3 800 cm-1。应用光谱处理软件OMNIC for Raman 6.0对获取的光谱数据进行基线校正，获得不同分类组织的平均光谱，通过分类平均光谱相减获得正常组织、白斑、鳞状细胞癌光谱间的差异光谱，结合以往拉曼光谱研究中所获得峰位置归属指认差异光谱中特征峰所代表的化学物质变化信息。

1.3 化学计量法分析

对基线校正的谱图采用Matlab软件的小波函数bior4.4进行平滑处理，采用四川大学化学学院分析化学教研室编写的Matlab支持向量机程序建立不同疾病的拉曼光谱数据诊断模型，采用“留一法”校验诊断模型的准确度，计算其特异性、灵敏度、准确度、Matthew相关系数[9]和预测稳定性[10]。相关公式如下：特异性Matthew相关系数MCC=预测稳定性error其中，TP为正样本预测正确数，FP为正样本预测错误数，TN为负样本预测正确数，FN为负样本预测错误数。

2 结果

本研究共获得正常、白斑及鳞状细胞癌病变区域的特征性拉曼光谱154张，其中正常组织46张，轻度异常增生40张，中度异常增生16张，重度异常增生32张，鳞状细胞癌20张。正常组织、白斑及鳞状细胞癌的平均光谱见图1。从图1可见，不同病变类别的光谱在600～1 800 cm-1波数范围内存在一定的差异。

图 1 正常组织、白斑及鳞状细胞癌的平均光谱Fig 1 Mean Raman spectrum of normal tissue,OLK and OSCC

2.1 平均差异光谱分析

鳞状细胞癌与正常组织、白斑与正常组织、鳞状细胞癌与白斑间的差异光谱见图2～4。从图2可见，口腔正常黏膜与鳞状细胞癌的平均光谱差异明显，主要在500～2 200 cm-1范围内，其中747、897、930、1 060、1 092、1 125、1 610及1 666 cm-1峰位的增强提示在鳞状细胞癌中DNA、蛋白及脂类合成增强，表现出较明显的增殖活性，而在3 250 cm-1峰位的减弱提示其蛋白质N－H伸缩震动降低，也可作为诊断的标准。白斑与正常组织相比其差异没有鳞状细胞癌与正常组织明显，具有意义的是，751、780和1 071 cm-1峰位的增强提示其色氨酸、DNA及脂质含量升高，显示较强的增殖活性，而白斑在3 250 cm-1峰位的降低也可作为诊断依据（图3）。鳞状细胞癌相对于白斑，其差异主要在500～2 200 cm-1范围内，其中747、897、1 060、1 092、1 125、1 344及1 610 cm-1峰位的增强，提示在鳞状细胞癌中DNA、蛋白及脂类合成较白斑增强，表现出较强的增殖活性，但此差别较鳞癌与正常组织差别明显减弱（图4）。

图 2 鳞状细胞癌与正常组织间的差异光谱Fig 2 Subtracted mean spectrum of normal tissue and OSCC

图 3 白斑与正常组织间的差异光谱Fig 3 Subtracted mean spectrum of normal tissue and OLK

2.2 化学计量法诊断分类

在经过小波变换后，对不同分类组织的拉曼光谱信息通过支持向量机进行分析。选择正则化参数C＝3，核函数宽度σ＝2，在46个正常组织的拉曼光谱中，45个样本被归于正常组，正确率97.83%；在20个鳞状细胞癌的拉曼光谱中，全部光谱都被划分于鳞状细胞癌组，正确率100%。

图 4 鳞状细胞癌与白斑间的差异光谱Fig 4 Subtracted mean spectrum of OLK and OSCC

选择正则化参数C＝3，核函数宽度σ＝2，在46个正常组织的拉曼光谱中，27个样本被归于正常组，正确率58.70%；在88个白斑的拉曼光谱中，74个样本归于白斑组，正确率84.09%。去除轻度异常增生的拉曼光谱后，选择正则化参数C＝3，核函数宽度σ＝4，在46个正常组织的拉曼光谱中，有38个样本被归于正常组，正确率82.61%；在48个白斑的拉曼光谱中，39个样本被归于白斑组，正确率81.25%。

选择正则化参数C＝3，核函数宽度σ＝1，在20个鳞状细胞癌的拉曼光谱中，19个样本被归于鳞状细胞癌组，正确率95.00%；在88个白斑的拉曼光谱中，85个样本被归于白斑组，正确率96.59%。去除重度异常增生的拉曼光谱后，选择正则化参数C＝3，核函数宽度σ＝1，结果在38个鳞状细胞癌拉曼光谱中，所有样本都被归于鳞状细胞癌组，正确率100%；在56个白斑的拉曼光谱中，53个样本归于白斑组，正确率94.64%。

根据以上结果，计算所得诊断模型分类的特异性、灵敏度、准确度、Matthew相关系数和预测稳定性见表1。

表 1 支持向量机分类参数Tab 1 Classification parameter of support vector machine

3 讨论

近红外拉曼光谱具有以下特点而适合于人体组织检测[3]：1）人体组织对近红外波长激发光的消光系数较小，光束能够更深地进入组织，为较大组织块和表面下层组织的研究提供机会；2）更小的光吸收可降低样品的光分解作用，从而可应用更高的激光能量激发试样，获得更强烈的拉曼散射效应；3）近红外波长的激发光能轻易通过光导纤维传递，为近距离获得组织样本的诊断性拉曼光谱提供可能；4）水份对近红外激光的吸收作用很弱，从而在近红外拉曼光谱检测中消除了水份干扰，在水份构成70%～95%细胞组分的情况下，这一特点尤为重要。

Krishna等[4]应用显微拉曼光谱仪结合近红外拉曼光谱仪分析，发现正常组织、良性肿瘤及恶性肿瘤的平均光谱存在明显差异；恶性肿瘤的平均光谱与正常组织差别较大，最明显的表现为酰胺Ⅰ带强度下降、δCH2带轻微位移、800～1 200 cm-1波数范围内多个谱带及酰胺Ⅲ带强度相对改变，这可以作为区分不同病变的标准。Kumar等[5]对正常和恶变的新鲜胃黏膜进行近红外拉曼光谱扫描发现，在酰胺Ⅰ、Ⅲ带和△CH2相应波数范围内，正常胃黏膜中含有更高的脂质成分，而恶变黏膜中蛋白质成分更加丰富。本研究通过不同组织分类的平均差异光谱发现，相对于正常口腔黏膜，白斑和鳞状细胞癌在活跃增殖过程中，由于其分裂、生长加速而伴有明显的遗传物质含量升高、细胞合成功能增强，从而导致细胞内RNA、DNA及相应核苷酸、蛋白质及脂类含量升高，在其拉曼光谱上以特征峰或相应峰值升高表现出来，可以用作鉴别诊断。

拉曼光谱数据中包含大量无关紧要的信息，在保证拉曼光谱基本特征不变的前提下，需要结合化学计量学方法提取其中有意义的内容，并去除伪峰干扰以建立判别模型，为恶性肿瘤诊断和治疗提供客观依据。本研究采用支持向量机进行分析，它是一种具有学习功能的计算分析方法，其最大的特点在于其所需的训练数据集较小，结果比较稳定，鉴于研究中样本数量限制及诊断准确性的要求，这一点在医学研究中尤为重要。

在对鳞状细胞癌和正常组织的建模比较中，诊断模型的分类功能较强大，其对于鳞癌和正常组织的分类结果较准确，并且诊断模型预测稳定性较高。白斑与正常组织的分类比较结果并不十分理想。在去除训练集中轻度异常增生的数据后，其分类效果有所提高，由此可知白斑与正常组织的拉曼光谱存在客观差别，但鳞癌和正常组织的差别明显减小，这说明白斑在正常组织和鳞癌间处于过渡状态；在去除轻度异常增生的训练数据后，两者间的分类效力提高，其原因可能在于轻度异常增生与正常组织差别较小，从而在所有白斑样本和正常组织的对比中削弱了中、重度异常增生的光谱特异性，导致白斑总体与正常组织的分类效力降低。

鳞状细胞癌与白斑的分类比较结果较为理想。在去除训练集中重度异常增生的数据，其分类效果有所提高，尤其是分类准确度和稳定性提高明显。由此可以推论鳞状细胞癌与白斑存在较明显的差异，其差异程度较白斑和正常组织更大，说明白斑在组织分化上更靠近正常组织；在去除重度黏膜异常增生的训练数据后，模型分类效果有所提高，这一结果与病理分类相互印证，即在病理分类中，重度黏膜异常增生已表现明显的恶性倾向，发生恶变的关键性突变机会较轻、中度异常增生更大；此外，在病理分类中的误判也可能造成以上分类结果的改变，即将鳞状细胞癌误分于重度黏膜异常增生组，从而导致差异减小，影响分类效力。

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